一、光电比浊计数法
实验目的
学习光电比浊计数法的原理，掌握用比浊法测定酵母菌数量的方法。
实验原理
当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定浓度范围内，悬液中菌体数量与光密度（optical density，即OD值）成正比，与透光度成反比，而OD值可由光电比色计精确测定。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定OD值，作出OD―数的标准曲线，而后将样品液所测得的OD值从标准曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时，活菌计数可采用血球计数板计数法或平板菌落计数法。本法优点是简便、快速，可以连续测定，适合于自动控制，但不适用于多细胞微生物的生长测定，以及颜色太深的样品或在样品中含有颗粒性杂质的悬液测定。
光电比浊计数法已在发酵工业广泛采用。直接用比浊法测得的OD值，查标准曲线，常用于跟踪观察各个培养时期细菌或酵母菌的菌数消长情况，如生长曲线的测定和发酵罐中的细菌或酵母菌的生长情况等。由于OD值受菌体浓度（仅在一定范围内与OD值成直线关系）、细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响，因此，首先要调节好待测菌液的细胞浓度，选择好光波长，通常在400～700nm之间；其次应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。还要注意培养基的成分和代谢产物不能在所选用波长范围有吸收。
实验材料
（一）菌种
啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培养液。
（二）试剂
0.85%无菌生理盐水。
（三）仪器与其他用具
721型分光光度计、血球计数板、显微镜、无菌试管、滤纸、无菌吸管。
实验流程
调整菌液浓度→测OD值→绘制标准曲线→样品测定
实验步骤
（一）制作标准曲线
1.调整菌液浓度
取无菌试管7支，分别用记号笔将试管编号为1、2、3、4、5、6、7.用血球计数板计数培养24h的啤酒酵母菌悬液，并用无菌生理盐水分别稀释调整为每1mL1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106（个）含菌数的细胞悬液，再分别装入已编好号的1～7号无菌试管中。
2.测OD值
将1～7号不同浓度的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定OD值。注意：每管菌悬液在测定OD值时均必须先摇匀后再倒入比色皿中测定。比色测定时，以无菌生理盐水作空白对照，并调零点，将OD值。
3.绘制标准曲线
以OD值为横坐标，以每1mL细胞数的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。
（二）样品测定
将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇均匀后，用560nm波长、1cm比色皿测定OD值。测定时用无菌生理盐水作空白对照，并调零点。各种操作条件必须与制作标准曲线时的相同，否则，测得样品OD值所换算的含菌数不准确。根据所测得的OD值，从标准曲线查得每1mL的含菌数。
实验结果与报告
计算每1mL样品原液的菌数，并对结果进行误差分析。比较这种计数方法有何优缺点？
每1mL样品原液菌数=从标准曲线查得每1mL的菌数×稀释倍数
二、用比浊法测定细菌的生长曲线
实验目的
（1）了解细菌生长曲线的特点，学会用比浊法测定细菌生长曲线的原理和方法。
（2）复习光电比浊法测量细菌数量的方法，绘制细菌生长曲线。
实验原理
将一定数量的细菌接种于新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，细胞生长要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。各时期的长短因菌种本身特征、培养基成分和培养条件不同而异。以培养时间为横坐标、以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作出的曲线称为生长曲线。测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。
比浊法是根据细菌悬液细胞数与混浊度成正比，与透光度成反比关系，利用光电比色计测定细胞悬液的光密度（即OD值），用于表示该菌在一定条件下的相对生长量。不同种细菌在相同培养条件下其生长曲线各异，同一种细菌在不同培养条件下所绘制的生长曲线也不尽相同。本实验设正常生长、加酸抑制和加富培养等三种处理，以了解细菌在不同生长条件下的生长情况。
实验材料
（一）菌种
37℃培养至18h的大肠杆菌（Escherichia coli）培养液。
（二）培养基
牛肉膏蛋白胨液体培养基14支（10mL/支），浓缩5倍的牛肉膏蛋白胨培养基1支。
（三）试剂
无菌酸溶液（V甲酸□V乙酸□V乳酸=3：1□1）。
（四）仪器与其他用具
1mL无菌吸管、恒温水浴摇床、冰箱、721型光电比色计、标签等。
实验流程
接菌→分装→培养→分时取出冷藏→测OD值→绘制生长曲线
实验步骤
（一）常规方法
1.接种
取13支装有牛肉膏蛋白胨培养液的试管，贴上标签（注明菌名、培养处理、培养时间和组号）。按无菌操作法用吸管向每管准确加入0.2mL的大肠杆菌培养液，接种后，轻轻振荡，将菌体混匀。另一支不接种的培养管注明对照。
2.培养
将接种后的培养管置于摇床上，在37℃振荡培养（振荡频率250r/min）。其中9支培养管分别于培养的0、1.5、3、4、6、8、10、12和14h后取出，放冰箱中贮存，待测定。
（1）加酸处理 取出经4h培养的另2支培养管，按无菌操作法加入1mL无菌酸溶液，摇匀后，继续振荡培养，分别于培养8h和14h后取出放冰箱中贮存，待测定。
（2）加富营养物处理 余下的2支培养管于培养6h后取出，按无菌操作法加入浓缩5倍的牛肉膏蛋白胨培养液1mL作补料，摇匀后，继续振荡培养，分别于培养8h和14h后取出，放入冰箱中贮存，待测定。
3.比浊
将光电比色计开机预热10～15min，选用400～440nm波长的滤光片，将波长调至420nm，先以未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基调零点（以后每次测定都要重新校正零点），再将培养不同时间、形成不同细胞浓度的细菌培养液进行适当稀释，使OD420值在0.0～0.4范围内较好。在光电比色计上测定各稀释液的OD420值，从最稀浓度的菌悬液开始，依次测定。经稀释后测得OD420值要乘以稀释倍数，才是培养液的实际OD420值。
实验注意事项：测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布。测定OD值后，将比色杯中的菌液倾入容器中，用水冲洗比色杯，冲洗水也收集于容器中进行灭菌，最后用75%酒精冲洗比色杯。
（二）简便方法
按上述接种方法将大肠杆菌接入装有牛肉膏蛋白胨培养液的小试管中（试管要能插入放比色杯的比色槽内），37℃振荡培养，分别在0、1.5、3、4、6、8、10、12和14h取出，以未接种培养液调零点，将摇匀后的培养液试管直接插在光电比色计的比色槽中测定OD420值。比色时应自制一个暗盒将培养管和比色槽罩住，以形成暗室，并要求试管清洁，以提高测定准确度。
实验结果与报告
（1）将测定的OD值中。
（2）绘制生长曲线 以细菌悬液的光密度值（OD值）为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出大肠杆菌在正常生长、加酸处理和加富培养三种条件下的生长曲线。如果将上述培养至0、1.5、3、4、6、8、10、12、14h不同时间的细菌悬液，用平板菌落计数法测定其每1mL活菌数，则以菌悬液比浊的OD值为横坐标，以每1mL细菌数量的对数值为纵坐标，绘制一标准曲线。如此可通过测定任一培养时间的菌悬液OD值后，即可在此标准曲线上查出含菌数。
思考题
（1）比较三条生长曲线有何差异？为什么？
（2）如果用平板菌落计数法制作生长曲线，与光电比浊法相比，两者有无差异？它们各有什么优缺点？
（3）补充哪些实验可以通过测定OD值便可知样品中的活菌数。
