一、物理因素对微生物的影响
实验目的
（1）观测氧气、温度、紫外线对微生物生长的影响。
（2）认识细菌芽孢对热、紫外线的抵抗力。
实验原理
环境因素包括物理因素、化学因素和生物因素，不良的环境条件使微生物的生长受到抑制，甚至导致菌体的死亡。但是某些微生物产生的芽孢，对恶劣的环境条件有较强的抵抗能力。我们可以通过控制环境条件，使有害微生物的生长繁殖受到抑制，甚至被杀死；而对有益微生物，通过调节理化因素，使其得到良好的生长繁殖或产生有经济价值的代谢产物。
根据微生物对氧气的需求，可把微生物分为好氧菌、厌氧菌和兼性好氧菌。在鉴定细菌时，常以它们的好氧性作为指标。
温度是影响微生物生长的重要因素之一。根据微生物生长的最适温度范围，可分为高温菌、中温菌和低温菌，自然界中绝大部分微生物属于中温菌。
紫外线主要作用于细胞内的DNA，轻则使微生物发生突变，重则造成微生物死亡。紫外线照射的剂量与所用紫外光灯的功率、照射距离和照射时间有关。紫外线透过物质的能力弱，一层黑纸足以挡住紫外线的通过。
实验材料
（一）菌种
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、丙―醇梭菌、酿酒酵母。
（二）培养基
牛肉膏蛋白胨培养基（培养基4）、PDA培养基（培养基27）、察氏培养基（培养基22）。
（三）仪器及其他用品
培养皿、无菌圆滤纸片、镊子、无菌水、无菌滴管、水浴锅、紫外光灯、黑纸、试管、接种针、温箱、刮铲、吸管、调温摇床、分光光度计。
实验流程
（1）半固体培养基→接种→培养→观察比较→记录结果
（2）配培养液→选择温度→接种→培养→观察比较→记录结果
（3）培养液→接种→高温→培养→观察比较→记录结果
（4）标记平板→涂布接种→紫外线处理→培养→观察比较→记录结果
实验步骤
（一）氧气对微生物生长的影响
1.制备试管培养基
依据培养基配方制作牛肉膏蛋白胨半固体培养基，灭菌备用。
2.接种与培养
取上述试管7支，用穿刺接种法分别接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和酿酒酵母，每种菌接种2支培养基试管，剩余1支作为空白对照。注意：穿刺接种到上述培养基中时，必须穿刺到管底，在37℃恒温箱中培养48h。
3.观察结果
取出试验样品，观察各菌株在培养基中生长的部位。
（二）微生物生长的最适温度
1.配制培养基
配制牛肉膏蛋白胨培养液试管（标记A）和麦芽汁培养基试管（标记B），每管装5mL培养液，灭菌备用。
2.选择试验温度
取16支A培养液试管和8支B培养液试管，分别标明20℃、28℃、37℃和45℃4种温度，每种温度下A培养液4管，B培养液2管。
3.接种与培养
A试管分别接入培养18～20h的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌菌液0.1mL，混匀；同样B试管接入培养18～20h的酿酒酵母菌液0.1mL，混匀；每个处理设2个重复，并进行标记。放在标记温度下振荡培养24h。
4.观察结果
根据菌液的混浊度判断大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母生长繁殖的最适温度。
（三）微生物对高温的抵抗力
1.微生物对湿热的抵抗力试验
（1）选取培养基 取16支A培养液试管，按顺序1～16编号。
（2）接种 其中8支（1，3，5，7……）培养液试管中各接入培养48h的大肠杆菌的菌悬液0.1mL，其余8支（2，4，6，8……）培养液试管中各接入培养48h的枯草芽孢杆菌的菌悬液0.1mL，混匀。
（3）高温水浴 将1～8号已接种的培养液试管同时放入50℃水浴中，10min后取出1～4号管，再过10min后，取出5～8号管。各管取出后立即用冷水或冰浴冷却。同样将9～16号已接种的培养液试管同时放入100℃水浴中，10min后取出9～12号管，再过10min后，取出13～16号管。各管取出后立即用冷水或冰浴冷却。
（4）培养 将各管置于其最适温度的温箱中培养24h。
（5）观察结果 依据菌株生长状况记录结果。以“-”表示不生长，“+”表示生长，并以“+”、“++”、“+++”表示不同生长量。
2.微生物对干热的抵抗力试验
（1）制备菌悬液 取大肠杆菌、枯草杆菌斜面原菌种划线接种于牛肉膏蛋白胨试管斜面上，37℃培养1～2d，用5～10mL灭菌生理盐水洗下菌苔，制成浓度为108个/mL菌悬液。
（2）编号 取16支灭菌空试管，分别标注1～16号。
（3）接种 用灭菌镊子将无菌圆滤纸片分别浸入大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的菌悬液内，将大肠杆菌悬液中取出的滤纸片分别放入l、3、5、7……等单号试管中，在枯草芽孢杆菌悬液中取出的滤纸片分别放入2、4、6、8……等双号试管中。
（4）干热处理 将1～8号管放入50℃干燥箱中，10min后取出1～4号管，再隔10min后，取出5～8号管；同样将9～16号管放入100℃干燥箱中，10min后取出9～12号管，再隔10min取出13～16号的4支管。
（5）培养 以无菌操作将牛肉膏蛋白胨液体培养基分别注入上述试管各3～5mL，将带菌的滤纸片冲下，另取1支不带菌的液体培养基试管作为对照，置于37℃温箱中培养2d后，观察培养基混浊长菌情况，记录实验结果。
3.观察结果
根据菌液的混浊度判断大肠杆菌和枯草芽孢杆菌对高温的抗性试验。
（四）微生物耐热性D值与Z值的测定方法
1.D值的测定方法
（1）制备菌悬液 取枯草芽孢杆菌斜面原菌种划线接种于牛肉膏蛋白胨试管斜面上，37℃培养7d，革兰氏染色镜检芽孢数为85%以上，用5～10mL无菌pH7.0的磷酸盐缓冲液洗下斜面菌苔，制成浓度为108个/mL芽孢悬浮液。同法用无菌pH7.0的磷酸盐缓冲液制得大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的菌悬液。
（2）水浴或油浴热处理 将枯草芽孢杆菌孢子悬浮液置于盛pH7.0的磷酸盐缓冲液的试管中，取12支毛细管置于上述悬浮液试管中，待吸入菌液后（注意：每支毛细管所吸菌液应定量一致），用火焰封口后，置于100℃恒温水浴槽内加热（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌采用63℃恒温水浴加热），如果超过100℃，则采用油浴加热，每隔5min取出2支毛细管，迅速于冷水中冷却。
（3）倾注平板培养 分别将上述原孢子悬浮液及不同时间加热的孢子悬浮液以9mL无菌生理盐水按10倍稀释法进行适当稀释，用无菌吸管各吸取其中2～3个稀释度的稀释液1mL注入灭菌平皿内，每个稀释度做2个重复，倒入冷至45～50℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基约15mL，摇匀，待凝固，置于37℃温箱中培养1～2d，观察是否长出菌落。
（4）菌落计数 对长出菌落的同一稀释度的平皿进行计数，取平均值，按下列公式计算每1mL处理液的残存活菌数：
残存活菌数（CFU/mL）=平均菌落数×稀释倍数
（5）绘制热致死速度曲线求D值和热力致死时间 以加热时间为横坐标（min），残存活菌数的对数为纵坐标（CFU/mL），在半对数坐标纸上绘制100℃温度条件下，枯草杆菌的芽孢热致死速度曲线，并找出在此温度下，活菌数减少一个对数周期所需要的时间即为D100值。对未长出菌落的平皿可确定热致死时间，即加热处理菌液所需的时间，为该菌在一定温度下的热致死时间。
2.Z值的测定方法
用上述方法测定不同温度下（可间隔5℃）的热致死时间，而后以温度为横坐标（℃），热致死时间的对数为纵坐标（min），在半对数坐标纸上绘制热致死时间曲线，求出减少一个对数周期热致死时间所需升高的温度（℃）即为Z值。
3.报告结果
将实验测得的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的D值与Z值中。
（五）紫外线对微生物的影响
1.标记培养基
取牛肉膏蛋白胨培养基平板3个，分别标明大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等试验菌的名称。
2.接种
分别用无菌吸管取培养18～20h的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌菌液0.1mL（或2滴），加在相应的平板上，再用无菌刮铲涂布均匀。
3.紫外线处理
打开培养皿盖，用无菌黑纸遮盖部分平板，置于预热10～15min后的紫外灯下，紫外线照射20min左右，取去黑纸，盖上皿盖。
4.培养
在37℃培养箱中培养24h。
5.观察结果
观察菌株分布状况，比较并记录3种菌对紫外线的抵抗能力。
二、化学因素对微生物生长的影响
实验目的
（1）了解化学因素对微生物生长的影响。
（2）掌握检测pH、化学药剂对微生物生长的影响的方法。
实验原理
抑制或杀死微生物的化学因素种类极多，用途广泛，性质各异。其中表面消毒剂和化学治疗剂最为常见。表面消毒剂在极低浓度时，常常表现为对微生物细胞的刺激作用，随着浓度的逐渐增加，就相继出现抑菌和杀菌作用，对一切活细胞都表现活性。化学治疗剂主要包括一些抗代谢物，例如抗生素等。在微生物实验中，pH的变化也对微生物生长有很大影响。
实验材料
（一）菌种
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母、青霉菌、灰色链霉菌。
（二）培养基
牛肉膏蛋白胨培养基（培养基4）、PDA培养基（培养基27）、察氏培养基（培养基22）。
（三）试剂
青霉素、新洁尔灭、复方新诺明、2.5%碘酒、0.1%升汞水溶液（红药水）、5%石炭酸、0.05%龙胆紫液（紫药水）、75%酒精、100%酒精、1%来苏儿、0.2%甲醛（见附录IV）。
（四）仪器及其他用品
培养皿、无菌圆滤纸片、镊子、无菌水、无菌滴管、水浴锅、振荡器、游标卡尺、分光光度计。
实验流程
（1）化学药剂对微生物生长的影响
无菌培养皿→配菌悬液→滴加菌样→倒平板→药剂处理→培养→观察结果
（2）不同pH对微生物生长的影响
配培养基→配菌悬液→接种→培养→观察结果
实验步骤
（一）化学药剂对微生物生长的影响
1.配制菌悬液
取培养18～20h的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌斜面各1支，分别加入4mL无菌水，用接种环将菌苔轻轻刮下，振荡，制成均匀的菌悬液，菌悬液浓度大约为106CFU/mL。
2.滴加菌样
首先取3个无菌培养皿，每种试验菌一皿，在皿底写明菌名及测试药品名称。然后分别用无菌滴管加菌4滴（或0.2mL）菌液于相应的无菌培养皿中。
3.制含菌平板
将融化并冷却至40～50℃的牛肉膏蛋白胨培养基倾入皿中12～15mL，迅速与菌液混匀，冷凝备用。
4.化学药剂处理
用镊子取分别浸泡在土霉素、新洁尔灭、复方新诺明、2.5%碘酒、0.1%升汞水溶液（红药水）、5%石炭酸、0.05%龙胆紫液（紫药水）、75%酒精、100%酒精、1%来苏儿、0.2%甲醛药品溶液中的圆滤纸片各一张，置于同一含菌平板上。
5.培养
片刻后，将平板倒置于37℃温箱中，培养24h。
6.观察结果
观察抑菌圈，用游标卡尺测量抑菌圈的直径，并记录入。
（二）不同pH对微生物生长的影响
1.配制培养基
牛肉膏蛋白胨液体培养基（标记A），配制麦芽汁培养基（标记B），分别调pH至3、5、7、9和11，每种pH培养基3管，每管盛培养液5mL，灭菌备用。
2.配制菌悬液
取培养18～20h的大肠杆菌、酿酒酵母菌斜面各1支，加入无菌水4mL，制成菌悬液。
3.接种与培养
A培养基中接种大肠杆菌液1滴（或0.1mL），摇匀，置37℃温箱中培养24h。B培养基接种1滴（或0.1mL），摇匀，置28℃温箱中培养24h。
4.观察结果
根据菌液的混浊程度判定微生物在不同pH下生长情况。
思考题
（1）说明青霉素和链霉素的作用原理。
（2）通过实验说明芽孢的存在对消毒灭菌有什么影响？
