§§§第七节植物病原病毒的检验
一、直接检验
带毒种子或其他植物材料表现明显症状，能以肉眼和手持放大镜直接识别的实例甚少，大豆花叶病毒（Sowbanemosaic virus）侵染的大豆种子有以种脐为中心的放射形黑褐色斑纹，豌豆种传花叶病毒（Peaseedbornemosaic virus）造成种皮变色和开裂，蚕豆色病毒（Brodbeanstain virus）使蚕豆种子产生坏死斑。但是，种子症状仅表示母株受到病毒侵染，而不一定表明胚内有病毒侵染，从而不一定传毒。
二、生长检验
种子、苗木需在实验室内或防虫温室内适于植物生长与症状表现的条件下栽培，在生长期间根据症状检出病株。种子带毒可根据幼苗症状做初步鉴定，但仅适用于苗期有特征性症状的少数寄主——病毒组合。例如，检验莴苣种子传带莴苣花叶病毒（Lettucemosaic virus），大麦种子传带大麦条纹化叶病毒（Barleystripemosaic virus），菜豆种子传带菜豆普通花叶病毒（Beancommonmosaic virus）等。通常单凭症状难以做出诊断，这是因为病毒症状常与其他病原微生物引起的症状，甚至缺素症相混淆，病毒症状还因品种和病毒株系不同而有较大变化，以及可能发生潜伏侵染等，这些均限制了生长检验的应用。
三、指示植物鉴定
种子、苗木带毒以及在生长期检验中所发现的潜伏侵染的可疑病株，常用接种指示植物的方法予以鉴定。鉴定时多用病植物汁液、种子浸渍液或种子研磨制成的提取液摩擦接种指示植物，依据指示植物症状鉴定病毒种类。种传病毒的带毒率很低，对于危险性的病毒即使指示植物鉴定得出阴性结果，仍需采用血清学方法或电镜观察做进一步鉴定，使用指示植物鉴定法时要正确选择指示植物，适时接种。不同的环境条件对指示植物的表症有很大影响，甚至会表现隐症。
四、血清学检验
血清学检验依据抗原与抗体反应的高度特异性，在具备高效价抗血清情况下，血清学方法不需要复杂的设备，便于推广使用。常用的血清检验方法有以下几种。
1.沉淀反应测定
含有抗原的植物汁液与稀释的抗血清在试管中等量混合，孵育后即可产生沉淀反应，在黑暗的背景下可见絮状或致密颗粒状沉淀。为节省抗血清，提出了许多改进方法，如微滴测定法（Micro drop method），玻璃毛细管法（Glass capillary method）等，这些方法都适用于检疫检验中的病毒检索，但是灵敏度较低。
2.琼脂扩散法
将加热融化的琼脂或琼脂糖注入培养皿中，冷却后形成凝胶平板，在板上打孔，孔的直径为0.3～0.4cm，两孔间距0.5cm，然后将待测植株种子提取液和抗血清加到不同的孔中。测定液中若有抗原存在，则抗原、抗体同时扩散，相遇处形成沉淀带。经典的琼脂扩散法只适于鉴定能在凝胶中自由扩散的球形病毒。杆形和线形病毒粒子大于琼脂网径时，就不能在琼脂中自由扩散。加入SDS后，使病毒蛋白质外壳破碎，即克服这一缺陷而适用于多种形状的病毒。在检验大麦种子传带大麦条纹花叶病毒时，有人用剥离的种胚压碎后直接测定；在检测大豆花叶病毒和豌豆黑眼花叶病毒时，用幼苗胚轴切片供测，均取得较好的结果。在检疫检验中，琼脂双扩散法可用作常规病毒检索方法，该法灵敏度较高。用豆科植物种子提取液测定时，常出现非特异性沉淀，这可能是因为豆科种子富含凝集素（lectin）的缘故。
3.乳胶凝集法
用致敏乳胶吸附抗体制成特异性抗体致敏乳胶悬液，它与抗原反应后，乳胶分子吸附的抗体与抗原结合，凝集成复杂的交联体，凝集反应清晰可辨。检查大麦种子传带大麦条纹花叶病毒时，可取1周龄大麦幼苗嫩尖的榨取汁测定。
4.酶联免疫吸附法
该法是用酶作为标记或指示剂进行抗原的定性、定量测定。直接酶联法用特异性酶标抗体球蛋白检出样品中的抗原。操作时，先将等测抗原置入微量反应板凹孔中培育，在吸附抗原后洗涤，保留吸附孔壁的抗原，随后加入特异性酶标记抗体，经洗涤后保留与抗原相结合的酶标抗体，形成抗原抗体复合物，再加酶的底物形成有色产物，用肉眼定性判断或用酶标仪定量测定。间接酶联法利用抗家兔或鸡球蛋白的山羊抗体与酶结合制备的酶标记抗体，只要制备出抗原的家兔特异抗血清，不需要再制备酶标记抗体就可用以检出抗原。国内多用辣根过氧化物酶标记。操作时先将待测抗原吸附于微量反应板孔壁上，培育一定时间后洗涤，加入特异性抗血清，经培育和洗涤后再加入羊抗兔酶标抗体，最后加入酶的底物，并及时观察结果。酶联法已成功地用于检测包括种传病毒在内的多种病毒，其灵敏度高，有些病毒的浓度低至0.1μg/mL也能被检测出来，用种子提取液供测，效率高，可快速检测大量种子。该法有高度的株系专化性，可能将某些病毒感染的材料误判为健康的。
5.免疫电镜法
该法将病毒粒体的直接观察与血清反应的特异性结合起来检测病毒。现已用于检测多种作物种子传带的各类病毒。该法对抗血清质量的要求不甚严格，能使用效价较低或混杂有非特异性（寄主）抗体的抗血清。另外，该法灵敏度高，特异性范围较宽，无严格的病毒株系专化性，尤适于种传病毒检验。从干种子磨粉用缓冲液悬浮起到透射电镜观察的整个操作过程最快只需1.5h。
6.分子生物学检验
用于病毒检测的技术主要有核酸分子杂交技术和聚合酶链反应（PCR）。
分子杂交技术是基于病毒RNA或DNA链之间碱基互相配对的基本原理，是对病毒基因组的分析和鉴定。因此，具有灵敏度高，特异性强的特点。在病毒及类病毒的鉴定工作中愈来愈被广泛应用。通过一定的技术，制备带有标记物的目标病毒检测探针，和待检RNA或DNA进行核酸链之间碱基的特异配对，形成稳定的双链分子，然后通过放射性自显影或液闪计数来检测标样的核苷酸片段，达到检测目的。
PCR是一种体外快速扩增特定的DNA片段的技术。根据目标病毒的核酸序列合成特异性的两个3′端互补寡核苷酸引物（其他生物同理），在Taq酶的作用下，以假定目标检测物的核酸为模板，从5′→3′进行一系列DNA合成，由高温变性、低温退火和适温延伸三个反应组成一个周期，循环进行扩增DNA。目标DNA的出现，可以鉴别目标病毒的存在。PCR的检测灵敏度可达到10-3pg水平。
§§§第八节植物寄生线虫的检验
一、直接检验
适用检验固着在植物体内或以休眠状态生存于植物组织内线虫，如粒瘿线虫（Anguina）、根结线虫（root knot nematode）、胞囊线虫（Heterodera）、水稻干尖线虫等。
首先以肉眼和手持放大镜仔细检查种子，检出畸形、变色、干秕种子以及夹杂的土粒杂质等，做进一步检查。小麦粒瘿线虫（Anguina tritici）和剪股颖粒线虫（Shear of the nematode）都使寄主子实形成虫瘿。水稻茎线虫（Rice stem nematode）侵染的病粒变褐色，颖部不闭合，谷形瘠细或成为空谷。无性繁殖材料，从根系到茎、叶、芽、花等部位均应仔细检查，要特别注意根、块茎等部位有无根结、瘿瘤，根部有无黄色、褐色或白色针头大小的颗粒状物，须根有否增生，根部有否产生斑点、斑痕等症状。块根、块茎是否干缩龟裂和腐烂，叶、茎或其他组织是否肿大、畸形等症状。病材料可用浸泡、解剖和染色等方法检出线虫。可疑种子放入培养皿内，加入少量净水浸泡后，在解剖镜下剥离颖壳，挑破种子检查有无线虫。根、茎、叶、芽或其他植物材料洗净后切成小段置于培养皿内加水浸泡一定时间后，在解剖镜下解剖检查植物组织中有无线虫。检查水稻茎线虫可将病粒连颖及米粒在室温（20～30℃）下加灭菌水浸泡4～12h，振荡10min，低速（1500转/min）离心3min，弃去离心管内的上清液，吸取沉淀物制片镜检。
二、染色检验
适于检验植物组织中的内寄生线虫。烧杯中加入酸性品红乳酸酚溶液，加热至沸腾，加入洗净的植物材料，透明染色1～3min后取出用冷水冲洗，然后转移到培养皿中，加入乳酸酚溶液褪色，用解剖镜检查植物组织中有无染成红色的线虫。
三、分离检验
将病原线虫由寄主体内、土壤或其他载体中分离出来，再鉴定种类。
1.改良贝尔曼漏斗法
此法适于分离少量植物材料中有活动能力的线虫。基本装置是一个直径适当的漏斗，漏斗颈末端接一段乳胶管，用弹簧夹把管子夹住。漏斗放置在支架上，其内盛满清水。把检验的植物材料洗掉泥土后，切成0.5cm长的小段，放在纱布中包起来，轻轻地浸入漏斗内。线虫从植物组织中逸出，经纱布沉落到漏斗颈底，经12h或过一夜后，打开弹簧夹使胶管前端的水流到玻皿内，镜检线虫。
2.过筛检验法
本法用于从大量土壤中分离各类线虫。将充分混匀的土壤样品置于不锈钢盆或塑料盆中，加入2～3倍的冷水，搅拌土壤并振碎土块后过20目筛，土壤悬浮液流入第二个盆中并喷水洗涤筛上物，弃去第一个盆中和筛上的剩余物，第二个盆中的土壤悬浮液经1min沉淀后再按上法过150目筛，从筛子背面将筛中物冲洗到烧杯中，盆中土壤悬浮液再继续过325目和500目筛。筛中物收集在烧杯中静置20～30min，线虫沉积底部，弃去上清液，将沉积物转移到玻皿内镜检或吸取线虫鉴定。
3.漂浮分离法
本法利用干燥的线虫胞囊能漂浮在水面的特性分离土壤中的马铃薯金线虫（Potato Jin Xianchong）和各种胞囊线虫（Cyst nematode）。
芬威克漂浮法利用称为芬威克罐的装置进行分离。使用时先将漂浮筒注满水，并打湿16目筛和60目筛。风干的土壤经6mm筛过筛并充分混匀后取200g土样，放在16目筛内用水流冲洗，胞囊和草屑漂在水面并溢出，经簸箕状水槽流到底部60目筛中，用水冲洗底筛上的胞囊于瓶内，再往瓶内注水但不溢出，静置10min，胞囊即浮于水面，然后轻轻倒入铺有滤纸的漏斗中过滤，胞囊附着滤纸上，滤纸晾干后，放在双目解剖镜下观察。
简易漂浮法适于检查少量含有胞囊的土样。该法用粗目筛筛去风干土土样中的植物残屑等杂物，称取50g筛底土放在750mL三角瓶中，加水至1/3处，摇动振荡几分钟后再加水至瓶口，静置20～30min，土粒沉入瓶底，胞囊浮于水面，把上层漂浮液倒于铺有滤纸的漏斗中，胞囊沉着在滤纸上，再镜检晾干后的滤纸。
