本章学习重点：
了解维生素的分类及测定的意义；
熟悉各种维生素测定方法的原理及应用。
12.1概述
维生素是促进人体生长发育和调节生理功能所必需的一类低分子有机化合物。维生素的种类很多，化学结构各不相同，在体内的含量极微，但它们在体内调节物质代谢和能量代谢中起着十分重要的作用。各种维生素均为有机化合物，都是以本体（维生素本身）的形式或可被机体利用的前体（维生素原）的形式存在于天然食品中，其在体内不能合成或合成量不足，也不能大量储存于机体的组织中，虽然需要量很小，但必须由食物供给。人体一般仅需少量维生素就能满足正常的生理需要。若供给不足就要影响相应的生理功能，严重时会产生维生素缺乏病。
各种维生素的化学结构差别很大。科学家们发现维生素的生理作用与它们的溶解度有很大关系，所以其按溶解性的不同有脂溶性和水溶性维生素之分。脂溶性维生素包括维生素A、维生素D、维生素E、维生素K。在食物中它们常与脂类共存，在酸败的脂肪中容易被破坏。水溶性维生素包括B族维生素（维生素B1、维生素B2、烟酸、叶酸、维生素B6、维生素B12、泛酸、生物素等）和维生素C。水溶性维生素易溶于水而不溶于脂肪及有机溶剂中，对酸稳定，易被碱破坏。
食品和其他生物样品中的维生素分析，在测定动物和人体的营养需要量方面发挥了关键的作用。科学家需要准确的食品成分信息来计算营养素的膳食摄入，以在全世界范围内改善人类营养；从消费和工业生产角度出发，也需要可靠的分析方法来确保食品标签的准确性。
12.2维生素的测定方法
维生素的测定方法主要有化学法、仪器法。仪器分析法中紫外、荧光法是多种维生素的标准分析方法。它们灵敏、快速，有较好的选择性。另外，各种色谱法以其独特的高分离效能，在维生素分析方面占有越来越重要的地位。化学法中的比色法、滴定法，具有简便、快速、不需特殊仪器等优点，正为广大基层实验室所普遍采用。
12.2.1脂溶性维生素的测定
12.2.1.1维生素A的测定
维生素A是不饱和的一元多烯醇。在自然界有维生素A1和维生素A2两种。A1存在于哺乳动物及咸水鱼的肝脏中，即视黄醇。A2存在于淡水鱼的肝脏中，是3-脱氢视黄醇，其活性大约只有A1的一半。视黄醇的分子式为C20H30O，相对分子质量为286，结构式如下：
维生素A1还有许多种衍生物，包括视黄醛（维生素A1末端的-CH2OH氧化成-CHO）、视黄酸(-CHO进一步被氧化成COOH)、3-脱氢视黄醛、3-脱氢视黄酸及其各类异构体，它们也都具有维生素A的作用，总称为类视黄素。
维生素A的测定方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光法、气相色谱法和高效液相色谱法等，其中比色法应用最为广泛，这里主要介绍三氯化锑比色法。
维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，产生蓝色物质，其深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比。该蓝色物质虽不稳定，但在一定时间内可用分光光度计于620 nm波长处测定其吸光度。
根据样品性质，可采用皂化法或研磨法对样品进行处理。
(1)皂化法适用于维生素A含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干扰，但全部试验过程费时，且易导致维生素A损失。
(2)研磨法适用于每克样品维生素A含量大于5.0 μg样品的测定，如动物肝的检测。步骤简单，省时，结果准确。
样品中维生素A含量根据下列公式计算：
X=ρm×V×1001000
式中：X——样品中维生素A的含量，μg/100 g（或国际单位，每国际单位＝0.3 μg维生素A）；
ρ——由标准曲线上查得样品中含维生素A的含量，μg/mL；
m——样品的质量，g；
V——提取后加三氯甲烷定量之体积，mL；
1001000——将样品中维生素A由μg/g折算成mg/100 g。
说明及注意事项如下。
(1)三氯化锑比色法为国家标准方法，适用于食品中维生素A的测定。
(2)乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。在提取前，洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，可加几滴乙醇消除乳化。
(3)所用氯仿中不应含有水分。原因是三氯化锑遇水会出现沉淀，干扰比色测定。故在每1 mL氯仿中应加入乙酸酐1滴，以保证脱水。
(4)由于三氯化锑与维生素A所产生的蓝色物质很不稳定，通常6 s以后便开始退色，因此要求反应在比色杯中进行，产生蓝色后立即读取吸光值。
(5)如果样品中含β-胡萝卜素（如奶粉、禽蛋等食品）干扰测定，可将浓缩蒸干的样品用正己烷溶解，以氧化铝为吸附剂，丙酮己烷混合液为洗脱剂进行柱层析。
(6)三氯化锑腐蚀性强，不能洒在皮肤上，且三氯化锑遇水生成白色沉淀，因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。
12.2.1.2维生素D的测定
维生素D为一组存在于动植物组织中的类固醇的衍生物，因其有抗佝偻病作用，也称之为抗佝偻病维生素。目前己知的维生素D至少有10种，但最重要的是维生素D2和维生素D3。维生素D2又名麦角钙化醇，分子式为C28H44O，相对分子质量为396.66；维生素D3又名胆钙化醇，分子式为C27H44O，相对分子质量为384.65。维生素D2和维生素D3结构式如下：
食品中维生素D的含量很少，且主要存在于动物性食品中。维生素D的含量一般用国际单位(IU)表示，1国际单位的维生素D相当于0.025 μg的维生素D。几种富含维生素D的食品中维生素D的含量(IU/100 g)如下：奶油50，蛋黄150～400，鱼40～150，肝10～70，鱼肝油800～30000。
维生素D的测定方法有比色法、紫外分光光度法、气相色谱法、液相色谱法及薄层层析法等。其中比色法灵敏度较高，但操作十分复杂、费时。气相色谱法虽然操作简单，精密度也高，但灵敏度低，不能用于含微量维生素D的样品。液相色谱法的灵敏度比比色法高20倍以上，且操作简便，精度高，分析速度快，是目前分析维生素D的最好方法。这里主要介绍三氯化锑比色法。
在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物，呈色强度与维生素D的含量成正比。
皂化与提取同维生素A的测定。如果样品中有维生素A共存，可用以下方法进行分离纯化。
(1)分离柱的制备：取一支具有活塞和砂蕊板的玻璃层析柱。
第一层：加入无水硫酸钠，铺平整。
第二层：将celite 540置于碘值瓶中，加入石油醚，振摇，再加入聚乙二醇600，剧烈振摇，使其黏合均匀，然后倒入层析柱内。
第三层：加中性氧化铝。
第四层：加入无水硫酸钠。
轻轻地转动层析柱（图12-1），使第二层的高度保持在12 cm左右。
(2)纯化：先用石油醚淋洗分离柱，然后将样品提取液倒入柱内，再用石油醚继续淋洗。弃去最初收集的滤液，再用容量瓶收集淋洗液至刻度。将淋洗液移入分液漏斗中，加水洗涤3次（去除残留的聚乙二醇，以免与三氯化锑作用形成混浊物，影响比色）。将上述石油醚层通过无水硫酸钠脱水后，置于浓缩器中减压浓缩至干或在水浴上用水泵减压抽干，立即加入三氯甲烷溶解备用。
根据样品溶液的吸收值，从标准曲线上查出相应的含量，然后样品中维生素D含量根据下列公式计算：
X＝ρ×Vm×1000×100
式中：X——样品中维生素D的含量，mg/100g；
ρ——标准曲线上查得样品溶液中维生素D的含量，μg/mL（如按国际单位，每国际单位＝0.025 μg维生素D）；
V——样品提取后用三氯甲烷定容之体积，mL；
m——样品的质量，g。
说明及注意事项如下。
(1)食品中维生素D的含量一般很低，而维生素A、维生素E、甾醇等成分的含量往往都大大超过维生素D，严重干扰维生素D的测定，因此测定前必须经柱层析除去这些干扰成分。
(2)操作时加入乙酰氯可以消除温度的影响，使灵敏度比仅用三氯化锑提高约3倍，并可减少部分甾醇的干扰。
(3)此法不能区分维生素D2和维生素D3，测定值是两者的总量。
12.2.1.3维生素E的测定
维生素E又名生育酚，属于脂溶性维生素，是一组具有α-生育酚活性的化合物。食物中存在着α、β、γ、δ四种不同化学结构的生育酚和四种生育三烯酚，各种食物中它们的含量有很大差别，生理活性也不相同，其中以α-生育酚的活性最强，含量最多（约90％），其结构式如下：
维生素E广泛分布于动、植物食品中，含量较多的为麦胚油、棉子油、玉米油、花生油、芝麻油、大豆油等植物油料，此外肉、鱼、禽、蛋、乳、豆类、水果以及绿色蔬菜中也都含有维生素E。膳食中维生素E的活性以α-生育酚当量（α-TEs，mg）来表示，规定1 mg α-TE相当于1 mg d-α-生育酚的活性。1个国际单位（IU）维生素E的定义是1 mg d-α-生育酚乙酸酯的活性，1 mg d-α-生育酚＝1.49 IU维生素E。
维生素E的测定方法有：比色法、荧光法、气相色谱法、液相色谱法等。比色法操作简单，灵敏度较高，但对维生素E没有特异的反应，需要采取一些方法消除干扰。荧光法特异性强、干扰少、灵敏、快速、简便。高效液相色谱法具有简便、分辨率高等优点，可在短时间完成同系物的分离定量，是目前测定维生素E最好的分析方法。这里主要介绍荧光法。
样品经皂化、提取、浓缩蒸干后，用正己烷溶解不皂化物，在295 nm激发波长，324 nm发射波长下测定其荧光强度，并与标准α-维生素E作比较，即可计算出样品中维生素E的含量。
样品中维生素E含量根据下列公式计算：
X＝U×c×VS×m×1001000
式中：X——样品中α-维生素E的含量，mg/100 g；
U——样品溶液的荧光强度；
c——标准使用液的浓度，μg/mL；
V——样品稀释体积，mL；
S——标准使用液的荧光强度；
m——样品的质量，g。
说明及注意事项如下。
(1)对于α-维生素E含量高的样品，此方法灵敏度较比色法高得多；对于植物性样品，一般α-维生素E含量不多，而其他异构体含量较多。每一种同系物的激发波长和发射波长的荧光强度不尽相同，因此测定值多数不能代表真实值，测定误差较大。特别是当含有大量δ-维生素E时，测定值比真实值高得多，因为δ体的荧光强度比α体强70%。
(2)荧光法测定的样品为花生油，如测其他食品，需先抽提脂肪。经抽提脂肪后的样品其发射波长改为330 nm。
12.2.1.4胡萝卜素的测定
胡萝卜素广泛存在于有色蔬菜和水果中，它有多种异构体和衍生物，包括：α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、玉米黄素，还包括叶黄素、番茄红素。其中α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、玉米黄素在分子结构中含有β-紫罗宁残基，在人体内可转变为维生素A，故称为维生素A原。其中以β-胡萝卜素效价最高，每1 mg β-胡萝卜素约相当于167 μg(或560 IU)维生素A。β-胡萝卜素的结构式如下：
胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化分解。其属于脂溶性维生素，故可用有机溶剂从食物中提取。
胡萝卜素本身是一种色素，在450 nm波长处有最大吸收，故只要能完全分离，便可对其进行定性和定量测定。但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取β-胡萝卜素时，这些色素也能被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将胡萝卜素与其他色素分开。常用的方法有高效液相色谱法、纸层析法、柱层析法和薄层层析法。这里主要纸层析法。
试样经过皂化后，用石油醚提取食品中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离。剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450 nm波长下定量测定。
样品中胡萝卜素含量根据下列公式计算：
X＝m1m×V2V1×100
式中：X——样品中胡萝卜素的含量，以β-胡萝卜素计，μg/100g；
m1——在标准曲线上查得的胡萝卜素的含量，μg；
V1——点样体积，mL；
V2——样品提取液浓缩后定容体积，mL；
m——样品的质量，g。
说明及注意事项如下。
(1)纸层析法简便，色带清晰，最小检出量为0.11 μg。
(2)样品和标准液的提取一定要注意避免丢失。
(3)浓缩提取液时，一定要防止蒸干，避免胡萝卜素在空气中氧化或因高温、紫外线直射等分解。
(4)定容、点样、层析后剪样点等操作环节一定要迅速。
