20多年来，动植物细胞培养取得了不少进展，呈现了广阔的前景，但仍处于发展阶段，要进入工业化生产尚有许多问题需要解决。产率低、周期长、易染菌、光照难控制（植物细胞培养）、放大难、成本高等缺点限制了动植物细胞固定化培养的进一步应用，仅适用于高价值产品的生产。
2.微生物原材料
（1）产酶微生物
原始产酶微生物可以从菌种保藏中心和有关研究机构获得，但大多数的高产微生物是从自然界中经过分离筛选获得的。一般情况下，细胞所表达的酶量受到细胞的调节和控制，合成的酶主要是满足细胞自身生长和代谢的需要，是有限的。当酶成为发酵的目标产物时，野生型微生物就不能满足酶制剂生产的需要，因此，工业酶制剂生产中，所有微生物菌种都是通过遗传改造的高产酶菌株。
常用的产酶微生物有细菌、放线菌、霉菌、酵母等，同一种微生物经育种后可以用于不同酶的生产，不同微生物也可以用于具有相同功能酶的生产。
（2）微生物的发酵及产酶
有了优良的产酶菌株后，如何通过发酵实现微生物的大规模培养及产酶就成了关键。
培养基一般选用那些价格便宜、来源丰富又能满足细胞生长和酶合成需要的农副产品，如淀粉、糊精、糖蜜、葡萄糖等碳源物质，鱼粉、豆饼粉、花生饼粉及尿素等氮源物质。
微生物发酵产酶主要有两种方式：固体发酵和液体深层发酵。固体发酵是以麸皮、米糠等为基本原料，加入适量的水和无机盐，形成潮湿不溶于水的固体培养基，微生物在其上进行发酵产酶的一种培养技术。固体发酵法具有设备简单、便于推广的优点，但也具有发酵条件不易控制、劳动强度大、物料利用不完全、酶不易分离纯化的缺点，一般用于米曲（含大量糖化酶）、酱油曲（含大量蛋白酶）的生产及食品工业和饲料工业用酶的生产。
液体深层发酵是利用液体培养基，在发酵罐内进行搅拌通气培养的一种发酵方式，发酵过程需要一定的设备和技术条件，但原料的利用率和酶的产量都较高，培养条件容易控制。
目前，工业上主要采用液体深层发酵技术生产酶。
20世纪70年代，固定化细胞技术发展迅速，展示了良好的前景，将产酶细胞吸附在水不溶性载体（如活性炭、硅藻土等）上或包埋在多孔凝胶中，将其限制在一定的空间界限内，但细胞仍能保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。固定化细胞具有诸多优点：
（1）固定化细胞的密度大、可增殖，因而可获得高度密集而体积缩小的工程菌集合体，不需要微生物菌体的多次培养、扩大，从而缩短了发酵生产周期，可提高生产能力；（2）发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用；（3）发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化，提高产品质量等。
胞内酶等许多胞内产物不能分泌到细胞外的原因是多方面的，其中细胞壁作为扩散障碍是阻止胞内产物向外分泌的主要原因之一。随后发展的固定化原生质体技术为胞内酶的连续生产开辟了崭新的途径。
三、酶的分离和提纯
从动植物、微生物细胞或微生物发酵液中产生的酶一般需进行分离提纯后才能应用（一些胞内酶也可以直接利用整个细胞作为生物催化剂）。至于需提纯到何等纯度，这与酶的用途直接相关。一般用于科学研究的酶需要有较高的纯度，特别是用于酶结构研究时，应该使用酶蛋白的结晶；医用酶也需要有较高的纯度，特别是用于静脉注射的酶必须非常纯净以避免不良反应；用于食品工业的酶制剂纯度一般要求不高，但必须注意安全性；工业用酶制剂纯度通常也不高，但必须要达到一定的酶活力（催化能力）要求。
酶的分离纯化是一项十分复杂的过程，特别是需要高纯度的酶产品时更是如此。酶产品的价格构成中，分离纯化占的比重非常高，一般都占50％以上，有时甚至超过80％。这是由如下原因引起的：（1）酶的浓度低，而分离提纯的费用往往随着产物初始浓度的下降呈指数上升。（2）细胞破碎液或发酵液的组成非常复杂，存在大量与目标酶蛋白性质类似、分子量差不多的杂蛋白，将这些杂蛋白分离不是一件容易的事；（3）酶对环境条件非常敏感，比较容易失活。因此，酶的分离纯化一般都在低温、缓冲溶液中进行，无疑将增加分离成本。在酶的分离纯化过程中，保持酶的活性不受或少受破坏是一条必须时时刻刻都要牢记的原则，任何会影响酶活力的因素都必须仔细考虑，如温度、pH、离子强度、剪切力、有机溶剂等。
酶的分离纯化一般包括预处理、初步纯化、高度纯化和浓缩与干燥几个过程。预处理包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物），初步纯化是除去与目的产物性质差异很大的杂质，高度纯化（精制）是除去与产物性质相似的杂质，浓缩与干燥（成品加工）则是使酶与溶剂分离的过程。
分离纯化的主要原理是：（1）根据分子形状和大小不同进行分离。如差速离心与超速离心、膜分离（透析、电渗析）与超滤法、凝胶过滤法。（2）根据分子电离性质（带电性）的差异进行分离。如离子交换法、电泳法、等电聚焦法。（3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。
如溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀法。（4）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附与吸附层析法。（5）根据配体特异性进行分离。如亲和层析法。
第三节 酶的改性
酶的改性是通过各种方法使酶的催化特性得以改进的技术过程。酶具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等显著特点。但在酶使用过程中，人们也发现酶存在各种不足，如稳定性差、具有抗原性、难以重复使用等。为此，科技工作者在这方面作了不少努力，以使酶的催化特性更加符合人们的使用要求。
可以使酶的催化特性得以改进的技术有多种，最主要的是酶分子修饰和酶固定化技术。
一、酶分子修饰
酶分子是具有完整的化学结构和空间结构的生物大分子，正是酶分子的完整空间结构赋予酶分子生物催化功能，使酶具有催化效率高、专一性强和作用条件温和等特点。但是另一方面，也是酶的分子结构使酶具有稳定性较差、活性不够高和可能具有抗原性等弱点。通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程称为酶分子修饰。
（一）化学修饰
1.金属离子置换修饰
把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的功能和特性发生改变的修饰方法称为金属离子修饰。金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。通过金属离子置换修饰，有可能提高酶活力，增加酶的稳定性。
有些酶中的金属离子往往是酶活性中心的组成部分，对酶催化功能的发挥有重要作用。
例如，α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+）、谷氨酸脱氢酶中的锌离子（Zn2+）、过氧化氢酶中的铁离子（Fe2+）等。α-淀粉酶分子中大多数含有钙离子，有些则含有镁离子或锌离子等其他离子，所以一般的α-淀粉酶是杂离子型的。如果将其他杂离子都换成钙离子，则可以提高酶活力，并显著增强酶的稳定性。结晶的钙型α-淀粉酶的活力比一般结晶的杂离子型α-淀粉酶的活力提高3倍以上，而且稳定性大大增加。故此，在α-淀粉酶的发酵生产、保存和应用过程中，增加一定量的钙离子，有利于提高和稳定α-淀粉酶的活力。
2.大分子结合修饰通过水溶性大分子修饰剂，如聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐与酶蛋白的侧链基团通过共价键结合，可使酶的空间构象发生改变，使酶活性中心更有利于与底物结合，并形成准确的催化部位，从而使酶活力提高。例如，每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍等。
酶的稳定性可以用酶的半衰期表示。酶的半衰期是指酶的活力降低到原来活力的一半时所经过的时间。酶的半衰期长，则说明酶的稳定性好；半衰期短，则稳定性差。例如，超氧化物歧化酶（SOD）在人体血浆中的半衰期仅为6分钟，经过分子结合修饰，其半衰期可以明显延长。
酶大多数是从微生物、植物或动物中获得的，对人体来说是一种外源蛋白质。当酶蛋白非经口（注射等）进入人体后，往往会成为一种抗原，刺激体内产生抗体。产生的抗体可与作为抗原的酶特异地结合，使酶失去其催化功能。抗体与抗原的特异结合是由它们之间特定的分子结构所引起的。通过酶分子修饰，使酶蛋白的结构发生改变，可以大大降低或消除酶的抗原性，从而保持酶的催化功能。例如，精氨酸酶经聚乙二醇结合修饰后，其抗原性显著降低；L-天冬酰胺酶经聚乙二醇结合修饰后，抗原性完全消除。
3.肽链修饰
（1）肽链切断修饰
酶蛋白的抗原性与其分子大小有关，大分子的外源蛋白往往有较强的抗原性，而小分子的蛋白质或肽段的抗原性较低或无抗原性。若采用适当的方法使酶分子的肽链在特定的位点断裂，断裂后，其酶活性中心的空间构象不变，相对分子质量减少，就可以在基本保持酶活力的同时使酶的抗原性降低或消失。例如，木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，除去其肽链的三分之二，该酶的活力基本保持，其抗原性却大大降低；又如，酵母的烯醇化酶经肽链有限水解，除去由150个氨基酸残基组成的肽段后，酶活力仍然可以保持，抗原性却显著降低。
若主链的断裂有利于酶活性中心的形成，则可使酶分子显示其催化功能或使酶活力提高。例如，胰蛋白酶原用胰蛋白酶进行修饰，除去一个六肽，从而显示胰蛋白酶的催化功能；天冬氨酸酶通过胰蛋白酶修饰，从其羧基末端切除10多个氨基酸残基的肽段，可以使天冬氨酸酶的活力提高4-5倍。
此外，还可通过肽链的断裂探测酶活性中心的位置。如果主链的断裂引起酶活性中心的破坏，酶将丧失其催化功能。
（2）氨基酸置换修饰
将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称为氨基酸置换修饰。
酶分子经过组成单位置换修饰后，可以提高酶活力，增加酶的稳定性或降低抗原性。如将酪氨酸-RNA合成酶第51位的苏氨酸由脯氨酸置换，修饰后的酶对ATP的亲和性提高了近100倍，酶活力提高了25倍。又如将T4溶菌酶中的第3位的异亮氨酸置换成半胱氨酸后，其酶活力保持不变，但该酶对热的稳定性却大大提高。又如将猪胰岛素B链第30位的丙氨酸置换成苏氨酸，猪胰岛素即变为人胰岛素，大大消除抗原性。
4.酶蛋白的侧链基团修饰
酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团，主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。
通过酶的侧链基团修饰，可以提高酶的活力、增加酶的稳定性、降低酶的抗原性，并且可能引起酶催化特性和催化功能的改变，以提高酶的使用价值。
此外，酶蛋白的侧链基团修饰还可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响，在研究酶的活性中心中的必需基团时经常采用。如果某基团修饰后不引起酶活力的变化，则可以认为此基团是非必需基团；如果某基团修饰后使酶活力显著降低或丧失，则此基团很可能是酶催化的必需基团。
（二）物理修饰
通过物理因素，特别是极端条件（高温、高压、高盐、极端pH值等）的作用，不改变酶的组成单位及其基团，不改变其共价键，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。
酶分子的空间构象的改变还可以在某些变性剂的作用下，首先使酶分子原有的空间构象破坏，然后在不同的物理条件下，使酶分子重新构建新的空间构象。例如，首先用盐酸胍使胰蛋白酶的原有空间构象被破坏，通过透析除去变性剂后，再在不同的温度条件下，使酶重新构建新的空间构象。结果表明，在20℃的条件下重新构建的胰蛋白酶与天然胰蛋白酶的稳定性基本相同，而在50℃的条件下重新构建的酶的稳定性比天然酶提高5倍。
二、酶的固定化
酶作为生物催化剂已被广泛应用于酿造、食品、医药等领域。在酶的应用过程中，人们注意到酶的一些不足之处，如稳定性差（即使在最适条件下，随着反应时间的延长，也往往会很快失活，反应速度会逐渐下降），对强酸强碱敏感；反应后不能回收，只能使用一次；分离纯化困难，只能采用分批法生产等，对于现代工业来说还不是一种理想的催化剂。
如果能设计一种方法，通过化学或物理的手段将酶定位于限定的空间区域内，但仍能进行底物和效应物（激活剂或抑制剂）的分子交换，保持其活性。经固定化的酶既具有酶的催化性质，又具有一般化学催化剂能回收、反复利用的优点，在大多数情况下，也能提高酶的稳定性。因此，在生产工艺上能够实现连续化、自动化，提高酶的使用效率，降低成本。
