北里柴三郎1852年10月20日生于日本熊本县的一个村吏家庭。少年时代的他，非常想当一名英雄武士，然而他的父母却把他送进私塾学习汉学，但是在他18岁时如愿以偿地进入藩校“时修馆”学习。明治维新后，随着废藩置县，“时修馆”亦自行解散，他的武士之梦也彻底破灭了。
1872年，北里柴三郎到熊本医学院学习，从此踏上了从医之途。他的学习成绩非常突出，在同学中出类拔萃，于是受到医学院里的教师、荷兰医生曼斯费尔德的重视。经过5年的寒窗苦读，北里柴三郎打下了坚实的医学基础。他听从了曼斯费尔德教授的建议，又在东京医学院苦读了8年。1883年毕业时，他获得“医学士”称号。
当时的细菌学在世界上还是一个新开辟的学科，霍乱菌刚被发现，结核菌也仅仅在1882年被发现。北里柴三郎应用所学的细菌学知识，在东京市内查出了鸡霍乱菌，又在长崎证实了存在的霍乱菌。日本内务省卫生局根据北里柴三郎出色的工作成绩，推荐他留学德国。
1886年，北里柴三郎留学德国，跟随著名的柏林大学教授、霍乱病菌的发现者罗伯特·柯霍学习，他研究的课题是当时许多细菌学者都未能突破的“破伤风菌的纯粹培养”。破伤风是由于伤口感染而造成的一种疾病，对人体危害极大。1889年，北里柴三郎留德后的第四年，终于研究成功“破伤风菌之纯培养”，并以这一伟大的发现而闻名于世。
1890年，北里柴三郎与罗伯特·柯霍共同创造了破伤风及白喉之血清疗法。为此，1891年日本文部省授予北里柴三郎“医学博士”称号，第二年5月，普鲁士政府授予他“教授”称号。
1892年，在德国埋头深造7年的北里柴三郎载誉归国时，正值日本各地传染病流行，霍乱、天花等疾病肆虐。在启蒙学家福泽谕之的大力支持和援助下，北里柴三郎建立了一个半官半民性的传染病研究所，并亲任所长。他在这个研究机构中培养了一批日本优秀的医学者，他们之中有以发现赤痢菌而闻名于世的志贺洁，有发明肠壁内原菌鉴别培养法的远藤滋，还有押田的狂犬预防液和梅野的痘苗改良等许多科研成果，对于公共卫生事业都作出了极大的贡献。
1894年，香港地区鼠疫猖獗，北里柴三郎亲自率领日本医务界前往香港调查鼠疫，不久他发现了鼠疫菌，并有效抑制了鼠疫的蔓延。
为了解决肺结核患者的医疗问题，北里柴三郎在福泽谕之的援助下，成立了私立的肺结核患者医疗休养所“土笔冈养生园”，继续进行肺结核菌的研究。
1914年，北里柴三郎与东京大学之间存在多年的矛盾终于爆发了，日本政府以“整顿行政”为借口，将传染病研究所从内务省移交文部省，将北里柴三郎驱逐出所。这次移交事件的发生，对于62岁的北里柴三郎是一个意外的打击，他愤然辞职，离开了他灌注了全部心血的研究所。研究所内的全体医学者、助手、护士、女工和零工，一起联名递交辞呈，决心与北里柴三郎同舟共济。在众人的拥戴下，北里柴三郎以坚强的决心和魄力，用“土笔冈养生园”积攒的经费，重新创设北里研究所，继续从事科研事业。
1931年6月13日，北里柴三郎在睡眠中因脑溢血故去，终年79岁。
北里柴三郎对于世界细菌学的发展作出了巨大的贡献，对于推广、普及和提高日本的细菌学事业付出了毕生的精力，日本人民深深地怀念他，把他誉为日本的“细菌学之父”。
