一、放线菌的形态观察
实验目的
（1）观察放线菌的基本形态特征。
（2）掌握培养放线菌的几种方法。
实验原理
放线菌一般由分枝状菌丝组成，它的菌丝可分为基内菌丝（营养菌丝）、气生菌丝和孢子丝3种。放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。孢子丝形态多样，有直、波曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等。它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。放线菌的菌落早期与细菌菌落相似，后期形成孢子菌落呈干燥粉状，有各种颜色呈同心圆放射状。
实验材料
（一）菌种
灰色链霉菌（Streptomyces griseus）、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）、细黄链霉菌（Streptomyces microfavus）。
（二）培养基
高氏I号培养基（培养基1）。
（三）仪器及其他用品
培养皿、载玻片、盖玻片、无菌滴管、镊子、接种环、小刀（或刀片）、水浴锅、显微镜、超净工作台、恒温培养箱。
实验流程
（1）插片法
倒平板→插片→接种→培养→镜检→记录绘图
（2）压印法
倒平板→划线接种→挑取菌落→加盖玻片→镜检→记录绘图
（3）埋片法
倒平板→切槽→接种→培养→镜检→记录绘图
实验步骤
（一）插片法
1.倒平板
将高氏I号培养基融化后，倒10～12mL于灭菌培养皿内，凝固后使用。
2.插片
将灭菌的盖玻片以45°角插入培养皿内的培养基中，插入深度约为培养基深的1/2或1/3.
3.接种与培养
用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线，放置28℃培养3～7d。
4.观察
培养后菌丝体生长在培养基及盖玻片上，用镊子小心地将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的菌丝体，将生长良好的菌丝体面向载玻片，压放于载玻片上。直接在显微镜下观察。
（二）压印法
1.制备放线菌平板
方法与倒平板相同。在凝固的高氏I号培养基平板上用划线分离法得到单一的放线菌菌落。
2.挑取菌落
用灭菌的小刀（或刀片）挑取有单一菌落的培养基一小块，放在洁净的载玻片上。
3.加盖玻片
用镊子取一洁净盖玻片，在火焰上稍微加热（注意：别将盖玻片烤碎），然后把盖玻片放在带菌落的培养基小块上，再用小镊子轻轻压几下，使菌落的部分菌丝体印压在盖玻片上。
4.观察
将印压好的盖玻片放在洁净的载玻片上（菌体朝向载玻片），然后放置在显微镜下观察。
（三）埋片法
1.倒琼脂平板
将已配制、灭菌的高氏I号琼脂培养基熔化，通过无菌操作倒入灭菌的培养皿底，使其凝固。一般直径Ф9cm的培养皿约倒入15mL培养基。
2.接种与培养
在已凝固的琼脂平板上用灭菌小刀切开两条小槽，宽度小于1.5cm。把放线菌接种在小槽边上，盖上已灭菌的盖玻片1或2片。将制作好的平板放在28℃恒温箱培养3～4d。
3.观察
取出培养皿，可以打开皿盖，将培养皿直接置于显微镜下观察；也可以取下盖玻片，将其放在洁净载玻片上，放在显微镜下观察。
实验结果
（1）观察并绘制放线菌的孢子丝形态，并指明其着生方式。
（2）绘图和描述自然生长状态下观察到的放线菌形态。
（3）比较不同放线菌形态特征的异同。
思考题
（1）在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？
（2）比较实验中采用的几种观察方法的优缺点。
二、酵母菌的形态观察
实验目的
（1）观察啤酒酵母的个体形态及其无性繁殖。
（2）观察假丝酵母的菌体结构、假菌丝以及繁殖特点。
实验原理
真菌是具有真正细胞核的真核生物，包括酵母菌、霉菌和大型真菌3大类型。本部分主要介绍如何观察酵母菌的显微形态结构。
酵母菌是单细胞的真核微生物，细胞核和细胞质有明显分化，个体比细菌大得多。酵母菌的形态通常有球状、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等多种。酵母菌的无性繁殖有芽殖、裂殖和产生掷孢子；酵母菌的有性繁殖形成子囊和子囊孢子。酵母菌母细胞在一系列的芽殖后，如果长大的子细胞与母细胞并不分离，就会形成藕节状的假菌丝。
实验材料
（一）菌种
啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、假丝酵母（Candida spp。）的试管斜面菌种。
（二）培养基
配制麦芽汁培养基（培养基26）、牛肉膏蛋白胨培养基（培养基4）、0.1%美蓝液、孔雀绿染液（见附录II）。
（三）仪器及其他用品
接种针、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、吸管、显微镜、镊子、恒温培养箱。
实验流程
啤酒酵母镜检→假丝酵母镜检→酵母菌死、活细胞镜检→子囊孢子镜检
实验步骤
（一）啤酒酵母形态观察
取一洁净载玻片，在载玻片上滴一滴无菌水，用接种环挑取少许啤酒酵母菌苔置于无菌水中，用接种环轻轻划动，使其分散成云雾状薄层；另取一盖玻片小心覆盖菌液。在显微镜下观察酵母细胞的形状、大小及出芽方式。
（二）假丝酵母观察
用划线法将假丝酵母接种在麦芽汁平板上，在划线部分加无菌盖玻片，于28～30℃培养3d，取下盖玻片，放到洁净载玻片上，在显微镜下观察呈树枝状分枝的假菌丝细胞的形状，或打开皿盖，在显微镜下直接观察。
（三）酵母菌死活细胞的检查
载片上加一滴0.1%的美蓝液，用接种环挑取少许酵母菌苔置于美蓝液滴中用接种环划动，使其分散均匀，加盖玻片，在显微镜下观察，死细胞为蓝色，活细胞无色。
（四）子囊孢子的观察
将啤酒酵母接种于麦芽汁液体培养基中，于28～30℃恒温箱中培养24h，连续转接培养3或4次；再转接到肉膏蛋白胨培养基中，再在25～28℃的恒温箱中培养3d左右，最后经过涂片染色后（按芽孢染色法），观察子囊孢子形状和特点，以及每个子囊内的孢子数等。
实验结果
把观察到的各种酵母绘图，并注明各部分名称。
思考题
（1）在酵母菌死、活细胞的观察中，使用美蓝液有何作用？
（2）比较假丝酵母与啤酒酵母形态的异同。
三、霉菌的形态观察
实验目的
（1）观察霉菌的菌丝以及菌丝体。
（2）观察霉菌营养和气生菌丝体的特化形态。
（3）学会用水浸法观察霉菌的技术。
实验原理
霉菌形态比细菌、酵母菌复杂，个体比较大，具有分枝的菌丝体和分化的繁殖器官。霉菌营养体的基本形态单位是菌丝，包括有隔菌丝和无隔菌丝。营养菌丝分布在营养基质的内部，气生菌丝伸展到空气中。营养菌丝体除基本结构以外，有的霉菌还有一些特化形态，例如假根、匍匐菌丝、吸器等。霉菌的繁殖体不仅包括无性繁殖体，例如分生孢子头、孢子囊等，包裹其内或附着其上的有各类无性孢子；还包括有性繁殖结构，例如子囊果，其内形成有性孢子。在观察时要注意细胞的大小、菌丝构造和繁殖方式。
实验材料
（一）菌种
黑根霉（Rhizopus nigricans）、总状毛霉（Mucor racemosus）、产黄青霉（Penicillumchrysogenum）、木霉（Trichodeerma spp。）、黑曲霉（Aspergillus nigricans）、犁头霉（Absidia spp。）等斜面菌种。
（二）培养基
乳酸石炭酸液（见附录II）、PDA培养基（培养基27）。
（三）仪器及其他用品
接种针、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、吸管。
实验流程
倒平板→接种→制片→镜检→描述绘图
实验步骤
（一）倒平板
将PDA培养基熔化后，倒10～12mL于灭菌培养皿内，凝固后使用。
（二）接种与培养
将青霉、木霉、毛霉、曲霉、根霉、犁头霉接种在不同的平皿中，置于28～30℃的恒温箱中培养3～7d。
（三）制水浸片
取洁净的载玻片，分别滴加1滴乳酸石炭酸液，挑取不同菌株的一团菌丝，分别置于不同的载玻片上（用记号笔标记菌株名称），加盖玻片。
（四）观察
1.观察木霉、毛霉、青霉、曲霉形态
选取标记木霉、毛霉、青霉、曲霉的载玻片，观察霉菌的菌丝及其分隔情况。观察菌丝体；观察分生孢子着生情况（要求辨认分生孢子梗、顶囊、小梗及分生孢子）。
（1）木霉 用低倍镜观察孢子囊梗、囊轴等，用高倍镜观察孢子囊孢子的形状、大小。将木霉斜面培养物置于显微镜载物台上，用低倍镜观察木霉的孢子囊梗粗细、孢子囊大小、形状、色泽等。
（2）毛霉 用低倍镜观察孢子囊梗、囊轴等，用高倍镜观察孢子囊孢子的形状、大小。将毛霉斜面培养物置于显微镜载物台上，用低倍镜观察毛霉的孢子囊梗粗细、孢子囊大小、形状、色泽等。
（3）曲霉 高倍镜下观察菌丝有无隔膜，分生孢子着生位置，辨认分生孢子梗、顶囊、小梗和分生孢子。
（4）青霉 在高倍镜下观察菌丝有无隔膜，分生孢子梗、副枝、小梗和分生孢子的形状等。
2.观察根霉形态
用低倍镜观察孢子囊梗、囊轴等，用高倍镜观察孢子囊孢子的形状、大小。将根霉斜面培养物置于显微镜载物台上，用低倍镜观察根霉的孢子囊柄、孢子囊、假根和匍匐枝。
3.观察犁头霉形态
选取标记犁头霉的载玻片，观察犁头霉的接合孢子。
（五）小室载玻片培养法
1.培养小室的灭菌
将略小于平皿底部的圆形滤纸片1张、U形玻璃棒、载玻片和两块盖玻片等按放入平皿内，盖上平皿盖，包扎后于121℃热灭菌30min，置60℃烘箱中烘干备用。
2.琼脂块的制作
取已灭菌的PDA琼脂培养基6～7mL注入另一灭菌平皿中，使之凝固成薄层。用解剖刀切成0.5～1.0cm2的琼脂块，并将其移至上述培养小室中的载玻片上（每片放两块）。制作过程应注意无菌操作。
3.接种和培养
用接种环或接种钩挑取很少量的青霉（曲霉、根霉、毛霉）的孢子接种于培养基四周，用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上，并轻压使之与载玻片间留有极小缝隙，但不能紧贴载玻片，否则不透气（注意：接种量要少，尽可能将孢子分散接种在琼脂块边缘上，否则培养后菌丝过于稠密，影响观察）。先在平皿的滤纸上加3～5mL灭菌的20%甘油（用于保持平皿内的湿度），盖上皿盖，注明菌名、组别和日期，置28～30℃培养3～5d。
4.镜检
培养1～2d后，可以逐日连续观察到孢子的萌发、菌丝体的生长分化和子实体的形成过程。将小室内的载玻片取出，直接用低倍镜和高倍镜观察霉菌的形态，重点观察曲霉分生孢子头和青霉的帚状枝形态，根霉和毛霉的孢子囊和孢子囊孢子，菌丝有无隔膜等情况。
实验结果
（1）把观察到的各种霉菌绘图，并注明各部分名称。
（2）列表比较根霉与毛霉，青霉与曲霉在形态结构上的异同。
思考题
（1）为何要用乳酸石炭酸溶液做霉菌水浸片？
（2）比较霉菌菌丝与假丝酵母菌丝的区别。
