实验目的
了解和掌握乳品加工用水中微生物的检测方法，监测乳品加工厂用水的卫生质量。
实验原理
水样的微生物检测主要是针对饮用水或预计用作饮用水的样品进行的，检测的目的是判断水是否可饮用。水中存在的细菌主要有三种类型：①水中本身带有的细菌；②土壤中的常驻菌；③寄生于人类和其他动物肠道中的正常菌。通常水中主要的细菌是革兰氏阴性菌（包括假单胞菌、黄杆菌、噬细胞菌、不动细菌和色素杆菌等），但也有一些革兰氏阳性菌（棒状杆菌、微球菌和杆菌）。水中少数的细菌是很难培养的，但大多数能在CPS培养基（培养基58）等低浓度的培养基中生长。水中绝大多数微生物不能在标准的营养琼脂或平板计数琼脂上生长。这些微生物的最适生长温度为25℃或更低，且需在平板上培养14d。营养琼脂或平板计数琼脂上生长的细菌数常常只有在CPS培养基上生长数的1/10.土壤中的常驻菌受雨水冲刷后进入溪流、池塘等地，这些细菌中有芽孢杆菌、链霉菌和肠杆菌科的肠杆菌等。它们的最适生长温度为25℃左右，并能在营养琼脂或平板计数琼脂上生长。
CPS培养基上活菌计数的结果取决于水样的来源。未污染的河水水样在平板上生长的菌落数相对要少，大约为100个/mL。尽管在暴雨后大量的土壤微生物被冲刷进河水中，但平板上菌落数的多少还要取决于河水的温度。城镇下游的水样中菌落数一般较多，部分原因是污水和工业用水排入河流所引起的。从城镇的河流入口处取水样检测，菌落数会超过106个/mL，而一般受污染的河流中细菌计数大约在104～2×105个/mL。未污染的湖泊和水库中的菌落总数一般为102个/mL或更少，但这一数值会受到水温的影响；未污染的深井水正常情况下菌落总数约为102个/mL或更少，发生污染时（如井发生渗漏）菌落数可能会很高，但一般仍然会低于104个/mL。用平板计数琼脂计数时，菌落总数大约是用CPS培养基计数结果的1/10，但对于严重污染的水样，两种琼脂在菌落计数上无显著差别。
饮用水和食品加工用水中菌落计数结果高预示着水质受到了污染且有非水源性细菌的存在，但并不能说明水受到了粪便、未净化的污水等的污染，受污染的水中的细菌大多数为土壤中的腐生菌。因此，仅凭菌落计数结果高不能说明就有肠道致病菌存在，但菌落计数高确实让人不可接受，因为它增加了对食品的危害性。
粪便污染可导致水中肠道致病菌的存在，这些细菌包括大肠杆菌、类肠球菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌，也可能有如沙门氏菌、大肠杆菌O157□H7、弯曲杆菌、霍乱弧菌和耶尔森氏菌等肠道致病菌的存在。在一定条件下，肠道致病菌能在水中存活相当长的时间。检测病原菌的方法见第二章的相关实验。
许多原生动物也存在引起水源性疾病的危害，这些病原微生物有小球隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）、表吮贾第虫（Giardia lamblia）和痢疾变形虫（Entamoebahistolytica）。现在已经有用于这类原生生物检测的改进的商品化的抗体检测系统。水中其他微生物的危害还包括由蓝细菌[Cyanobacteria（蓝绿藻类）]产生的毒素。
铜绿假单胞菌和气单胞菌也能在许多水生环境中生存、生长和繁殖。饮用水中的铜绿单胞菌通常并不引起肠炎等疾病，但却能造成伤口感染等接触性疾病的发生。
为了保证饮用水可饮用，必须确保水样不受上述致病微生物的污染。这些肠道致病菌，极易被肠道内共生的非致病性埃希氏杆菌、粪肠球菌和产气荚膜梭状芽孢杆菌等所掩盖，而这些非致病菌的指标菌却很容易检测。粪肠球菌作为指示菌不如大肠杆菌有效，因为它在肠道中的数量比大肠杆菌少，而且在水中很容易死亡。但偶尔粪肠球菌也可能会占优势，在少数动物体内，肠球菌的数量要超过大肠杆菌。产气荚膜梭状芽孢杆菌在水中比粪肠球菌和大肠杆菌的存活期长。如果水中不存在粪肠球菌和大肠杆菌，说明水源不存在粪便污染。但不幸的是，不存在常规的指示菌（如大肠杆菌等）并不能确保水中不存在隐孢子虫、贾第虫和病毒的污染。
然而，大肠杆菌、需氧嗜温菌和产气荚膜梭状芽孢杆菌的计数仍然很有用。另外，食品加工厂的加工用水还需要进行其他微生物的分析。例如对水中嗜热菌的类型和数量的检测和分析。
实验材料
（一）培养基
CPS培养基（培养基58）、普通营养琼脂（培养基4）、单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管（培养基66）、伊红美蓝琼脂（EMB）（培养基71）、乳糖发酵管（培养基67）、TTC琼脂（培养基105）等，其他致病菌检测请按照第二章相关实验准备。
（二）试剂
25%Ringer氏溶液、75%酒精（附录III）。
（三）仪器及其他用品
广口瓶（带有防尘磨口瓶塞）、无菌棉拭子、酒精灯、镊子、脱脂棉、恒温培养箱、显微镜等。
实验内容
（一）取样方法
1.自来水取样
取水样时，最好选用带有防尘磨口瓶塞的广口瓶。对于用氯气处理过的水，取样后在每100mL的水样中加入0.1mL 2%的硫代硫酸钠溶液。取样步骤如下：
（1）取样时应特别注意防止样品的污染，样品应完全充满取样瓶。
（2）用75%酒精将水龙头嘴的里外都擦干净。打开龙头让水流几分钟，关上龙头并用酒精灯灼烧，再次打开龙头让水流1～2min后再接水样并装满取样瓶。
（3）如果检测的目的是用于追踪微生物的污染源，则还应在龙头灭菌之前取水样或在龙头的里边和外边用棉拭子涂抹取样，以检测龙头自身污染的可能性。
2.其他水源取样
从水库、池塘、井水、河流等取水样时，建议用无菌的器械或工具拿取瓶子和打开瓶塞。在流动水中取样品时，瓶嘴应直接对着水流。如果不具备适当的取样仪器或临时取样工具，只能用手操作，但取样时应特别小心，防止用手接触水样或取样瓶内部。
（二）菌株检测
采样瓶完全装满（样品）后，应快速翻转25次，使之混匀，然后倒出大约1/4的样品，再以30cm的振幅振摇广口瓶25次，用25%Ringer氏溶液制备10倍系列稀释液至10-2.
1.需氧嗜温菌和嗜热菌的计数
用CPS培养基和普通营养琼脂分别在4.5℃、25℃、37℃培养14d、5d和2d。
2.大肠菌群
参见第二章实验15.
3.粪肠球菌
参见第二章实验29.
4.其他致病菌
参见第二章相关实验。
（三）滤膜法
需氧嗜温微生物、大肠菌群和类肠球菌的计数可用滤膜法。滤膜法的一个优点是能够检测到样本中少量的微生物，因为过滤的水量仅与水中悬浮物的量有关，而与其他因素无关。
水中需氧嗜温微生物检测可将水样过滤后，加入营养肉汤或胰蛋白胨大豆肉汤，然后将滤膜放在35～37℃培养18～24h或在25℃培养2d。大肠杆菌使用Millipore公司的HC型滤器。将滤膜放在含有饱和营养肉汤的滤膜垫上，37℃培养2h，然后将滤膜转移到含饱和麦康凯肉汤的滤膜垫上，44℃培养18h。用这种方法检测I型大肠杆菌只需1d。同样，检测粪肠球菌时先将滤膜在饱和营养肉汤垫上37℃培养2h，然后将滤膜转移到葡萄糖叠氮盐饱和肉汤滤膜垫上，40℃培养18h。
（四）微生物学标准
欧盟已制定出自来水中微生物的最大可接受含量（MACS），即总大肠菌群、粪大肠菌群和粪链球菌均为＜1/100mL，亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌为＜1/20mL。瓶装天然矿泉水和泉水的欧盟标准为：总大肠菌群、大肠杆菌、粪链球菌的最大含量（MACS）均为＜1/250mL，亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌为＜1/50mL，铜绿假单胞菌为＜1/250mL。我国的饮用水卫生标准（GB5749-2006）对饮用水的微生物学指标规定。对于小型集中式或分散式供水系统要求菌落总数≤100CFU/mL。
综合训练
结合你实习的工厂，检测加工用水和水源的微生物学指标。
