实验目的
掌握从凝胶中回收DNA的方法。
实验原理
从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段有多种方法，较早采用的有纤维素膜电泳回收法和透析袋电洗脱法等。这些方法操作复杂，DNA回收率低。近年采用的玻璃奶（glassmilk）回收法和柱回收法，操作简便，回收率高。柱回收法是将Sephadex或Sephacel等树脂做成层析柱，从琼脂糖中吸附带负电的DNA分子，再用洗脱液将DNA从层析柱上洗脱下来，从而达到回收和纯化DNA的目的。
实验材料
（一）试剂
现在DNA回收试剂盒的品种较多，但操作大同小异，现以实验室常用的小量胶回收试剂盒（带T1溶液，S1液，W1液）为例来说明回收方法。
T1溶液：2mmol/LTris□HCl（pH8.0～8.5）。
S1液：90.8gNaI+1.5gNa2S溶于1000mL蒸馏水中，用0.45μm滤膜过滤，再加0.5gNaI至饱和，避光保存。
W1液：70%乙醇。
（二）仪器及其他用品
电泳仪、电泳槽、微量移液管、离心管、台式离心机。
实验流程
实验步骤
（一）切胶
首先将要回收的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。然后在长波紫外灯（360nm）下观察电泳结果，用刀片割下含DNA的凝胶块，使其尽可能地小，放入1.5mL离心管中。尽可能多地去掉不含DNA的凝胶，这样对提高质量，简化操作均有好处。
（二）溶胶
（1）按每100mg凝胶加入300μLS1液的比例加入S1液，置50℃水浴10min，使琼脂糖块完全溶化，每2min颠倒混匀一次。如果琼脂糖质量小于100mg，用双蒸水补充至100mg，以确保体系总体积不至太小。对于高浓度的琼脂糖凝胶（＞2%）及一些特殊的胶，按100mg凝胶加入600μLS1液的比例加入S1.
（2）当目的片段＜500bp时，加入1/3S1液体体积的异丙醇混匀，50℃温浴1min，混匀。当目的片段＞500bp时，可省略此步骤，直接进行步骤（三）。
（三）回收
（1）将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000r/min离心30s，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。
（2）在吸附柱中加入500μLW1液，12000r/min离心15s，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。
如果室温低于20℃，离心前先静置1min。
（3）在吸附柱中加入500μLW1液，静置1min后，12000r/min离心15s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
（4）12000r/min离心1min。
（5）将吸附柱放入一个干净的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入30μLT1液，静置1min，12000r/min离心1min，用1.5mL离心管装DNA储存于-20℃，电泳检查回收是否成功。如果室温低于20℃，室温静置时间延长到5min，或者在50℃水浴静置2min，这样能确保DNA溶解并洗脱下来。
实验结果与报告
利用紫外凝胶成像系统观察回收产物的纯度及浓度，并作记录。
注意事项
（1）回收时，DNA的用量要比检查是否有DNA的存在的上样量大得多。
（2）T1液也可以用1mmol/LTE（pH8.0），或超纯水（pH＞7）替代。如果回收后的产物直接用于测序的话，最好用超纯水溶解。
（3）最终使用的洗脱体积不要小于20μL。
思考题
（1）从琼脂糖凝胶中回收DNA的原理是什么？
（2）如果要回收的DNA片段小于500bp，该怎么操作？
