实验目的
（1）了解食品微生物菌种复壮技术的三种方法。
（2）掌握发酵乳制品生产菌种的复壮方法。
实验原理
生产菌种在长期保藏过程中会发生衰退现象。衰退是指由于自发突变使某种微生物原有一系列生物学性状发生由量变到质变的现象。菌种衰退的原因是有关基因发生了负突变。衰退过程是一个从量变到质变的渐变过程。尽管个体的变异可能是一个瞬时的过程，但菌种呈现“衰退”却需要较长的时间。最初，在群体中只有个别细胞发生负突变，这时如不及时发现并采取有效措施而一味地传代，就会造成群体中负突变个体的比例逐渐增高，最后衰退细胞在数量上占优势，从而使整个群体表现出严重的衰退现象。
菌种衰退表现在以下几方面：①菌落和细胞形态的改变；②生长速度变慢或产生的孢子变少；③对生长环境的适应能力减弱；④生产性能下降。由于基因发生负突变，导致生产菌种对代谢产物的生产能力下降。例如，黑曲霉的糖化力、抗生素生产的发酵单位、各种发酵代谢产物的产量降低，以及酸乳菌种乳酸菌的活力或产乳酸能力下降等，都是明显的菌种衰退现象，可直接影响有关产品的产量和质量。因此，在使用保藏菌种之前需对菌种进行复壮。
狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的措施。广义的复壮是指在菌种生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，保证生产性能的稳定或逐步提高。常用的分离纯化方法大致分为以下三种：
（1）分离纯化
①菌落纯：即从种的水平上来说是纯的。例如，用将稀释菌液在琼脂平板上划线分离、表面涂布或先倾注接种平板再与尚未凝固的琼脂培养基混匀等方法获得单菌落。
②细胞纯：是单细胞或单孢子水平上的分离方法，它可达到细胞纯的水平。
（2）宿主复壮 对于寄生性微生物退化菌株，可直接接种到相应的动植物体内，通过寄主体内的作用来提高菌株的活性或提高它的某一性状。
（3）淘汰已衰退的个体 通过物理、化学方法处理菌体（孢子）使其死亡率达到80%以上或更高一些，存活的菌株一般比较健壮，从中挑选出优良菌种，达到复壮目的。
食品微生物菌种的复壮技术主要采用第一种方法。
实验材料
（一）待复壮菌种
德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp。bulgaricus，Lb）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，St）脱脂乳试管培养物（在冰箱中保藏至少2周）。
（二）培养基
改良MRS琼脂培养基（培养基9）、M17培养基（培养基15）。
（三）试剂
无菌生理盐水（9mL/试管，225mL/250mL三角瓶，内带玻璃珠）。
（四）仪器与其他用品
无菌吸管（25mL、1mL）、无菌培养皿、75%酒精棉球、金属勺、旋涡混合器、恒温培养箱、无菌超净工作台、酒精灯等。
实验流程
脱脂乳试管培养物→稀释→平板分离→观察菌落特征→纯化培养→观察个体形态特征→扩培→测定菌种活力
实验步骤
（一）样品稀释
将待复壮菌种培养液在旋涡混合器上混合均匀，用无菌吸管吸取样品5mL，移入盛有45mL无菌生理盐水带玻璃珠的三角瓶中，充分振荡混合均匀，即为10-1的样品稀释液。然后另取一支吸管自10-1三角瓶内吸取1mL移入10-2试管内，依此方法进行系列稀释至10-6.
（二）倾注法培养（平板分离）
用3支1mL无菌吸管分别精确吸取10-4、10-5、10-6的稀释液各0.1mL对号注入已编号的无菌培养皿中，倒入熔化并冷却至45℃左右的改良MRS琼脂培养基（或番茄汁琼脂培养基）10～15mL，于水平位置迅速转动平皿使之混合均匀。凝固后倒置于40℃温箱中培养48h或37℃培养48～72h。
（三）观察菌落特征
根据Lb或St的菌落特征内容，对上述平板长出的菌落进行肉眼观察，必要时在低倍镜下观察（勿打开皿盖，以防污染）。
（四）纯化培养
从上述不同培养基平板中分别挑取10个典型的Lb和St单菌落接种于MRS培养基和脱脂乳试管中，置40℃温箱中培养24h，牛乳培养基37℃培养至乳凝固。
（五）镜检形态
挑取上述试管培养物1环，进行涂片、革兰氏染色，油镜观察Lb或St的个体形态，确定菌种健壮、无杂菌污染后，进行菌种扩大培养。
（六）菌种扩大培养
按1%的接种量，将上述液体试管纯粹培养物接种于盛100mL灭菌脱脂乳的三角瓶中，另以同样方法分别接种具有较高活力的Lb或St作为对照，置于40℃温箱中培养至乳凝固，一般37℃培养过夜至乳凝固后进行菌种活力测定。
（七）测定菌种的活力
（1）肉眼观察 观察并记录用脱脂乳扩大培养菌种的凝乳时间。
（2）酸度测定 用NaOH滴定法测定Lb或St培养液的酸度。
（3）还原刃天青能力测定 测定还原刃天青所需的时间，具体操作参见实验31.
（4）活菌计数 采用稀释倾注平板培养法测定活菌数量，具体操作参见实验31.
实验结果与报告
描述德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌的菌落形态，并绘图说明它们的个体形态。根据凝乳时间最短、酸度最高、还原刃天青时间最短、活菌数最高挑选出优良菌株。
思考题
某乳品企业生产酸乳的菌种活力下降了（出现产酸慢的现象），请设计简明实验方案解决。
