实验目的
（1）了解牛乳自然发酵过程中微生物的菌群演替现象。
（2）了解酸牛乳的制作原理。
实验原理
刚采集的生牛乳含有细菌数量并不多。但是，由于牛乳的成分适合多种细菌生长，因此，在温度适宜的条件下，细菌繁殖很快，而且菌相出现交替演变的现象。一般刚采集的生牛乳的pH是中性，含有丰富的乳糖，有利于生牛乳中自然存在的乳酸细菌，例如乳链球菌（Streptococcus lactis）很快地繁殖。它们发酵乳糖产生乳酸，使牛乳的pH降低，并引起蛋白质凝结成乳酪状。低pH最终也抑制了乳链球菌的繁殖，被能耐受更低pH的菌种乳杆菌（Lactobacillus）所代替，它们完成乳糖发酵，并使pH更加降低。在这种低pH条件下酵母菌利用乳酸而生长。随着乳糖和乳酸的减少，pH再度上升，大部分假单胞菌（Pseudomonas）和芽孢杆菌（Bacillus）生长繁殖，它们产生的蛋白酶开始分解凝结了的牛乳蛋白质，当蛋白质被利用，牛乳的分解基本完成。
生牛乳的这种生态学演变的自然过程中，原始细菌的活动为以后的细菌创造了有利的生化条件，因而能观察到一个微生物群体接替另一微生物群体的一系列菌相演变。自然界其他微生物也会发生菌相的演变过程。
巴斯德消毒法可以杀灭牛乳中的病原菌，但不能杀灭芽孢杆菌，此法消毒过的牛乳，破坏了其中的正常菌群（除芽孢杆菌以外），因而不能产生带酸味的酸牛乳，而能越过演变的早期而趋向于更不适用的最后时期。故牛乳酸败的自然过程与乳品工业有密切的关系。现代工业生产的酸牛乳是先将牛乳进行消毒，而后接种纯种的乳链球菌与乳杆菌。
本实验将生牛乳原始样品和培养在30℃下的样品，定时取样分别测其pH并涂片，进行革兰氏染色，油镜下观察主要细胞的形态、排列、革兰氏阳性或阴性以及单个视野中的平均细菌数。每次涂片均取1接种环，涂抹载玻片约2.5cm2面积。
实验材料
（一）样品
生牛乳样品装入三角烧瓶内。
（二）试剂
革兰氏染色液、二甲苯等（见附录III）。
（三）仪器及其他用品
pH试纸、载玻片、盖玻片、显微镜等。
实验流程
匀样→测pH→涂片→存片→培养→循环→处理涂片→染色→观察计数
实验步骤
（1）混匀样品 旋转装牛乳的三角烧瓶，使样品充分混匀。
（2）测pH 用灭菌滴管或吸管以无菌操作取一滴牛乳或牛乳发酵液，放在pH试纸上，比色，记录。
（3）制作涂片 用无菌操作取满1接种环牛乳，在玻片上均匀涂抹2.5cm2（可先在纸上画2.5cm2的方格，然后将玻片放在纸上），玻片标明日期。
（4）储存涂片 玻片放空气中干燥。储存在一有盖盒内，待整个实验的所有涂片制成后一起进行第7以后的步骤或每片先进行第7步骤，再储存，待所有玻片制成后再进行第8以后的步骤。
（5）保温培养 牛乳样品放30℃温箱内培养。整个实验（约需10d）均需在此温度下培养。
（6）循环实验（测pH与涂片）每两天重复取样测pH和制作涂片。每次制作涂片用同一接种环，取同样的量。直至牛乳完成变酸过程和开始腐败为止。
（7）处理涂片 所有涂片都用二甲苯处理约1min，以除去牛乳的脂肪，干燥后，火焰固定。
（8）革兰氏染色。
（9）观察计数 油镜下观察，数几个视野的主要类型的细菌数，计算每一视野的平均数，描写细菌类型，注明形态、大小以及排列等性状。
实验结果与报告
（1）记录每次测得的pH和描写涂片中所观察到的细菌，并根据描写的细菌情况对照所介绍的各个时期的细菌特点，鉴别细菌类型。最后计算每一类型细菌在油镜下平均每视野的近似数。
（2）用的数据画曲线。
①pH曲线：以取样日期的垂直线与右面纵轴pH的水平线的交叉处画点，然后用连续线（――）连接各点。
②各细菌的曲线：以取样日期与左面各类型细菌的每视野平均数画交叉点，然后按各菌的曲线标记连接各点画曲线。
思考题
（1）用自己的实验结果说明细菌在牛乳的自然生态演变中是如何改变其环境的，又如何依次影响有关细菌的？
（2）经巴氏法消毒过的牛乳通过自然发酵，能否得到与生牛乳自然演变过程的同样结果？为什么？
（3）如果你利用生牛乳通过细菌自然发酵制造能饮用的酸牛乳，应控制在哪一时期？
