实验目的
了解乳与乳制品中嗜冷菌测定的原理，并掌握其操作方法。
实验原理
在乳品工业界“嗜冷菌”被定义为能够在7℃以及更低温度条件下生长繁殖，不论其最适生长温度条件是多少的一类微生物。在刚挤出的鲜乳中嗜冷菌数量占细菌总数的不到10%；而在冷藏条件下，嗜冷菌快速生长繁殖而成为牛乳中种群数量占优势的微生物菌群。在牛乳中发现的最常见的嗜冷菌为假单胞菌属（Pseudomonas），特别是荧光假单胞菌（Ps。fluorescens）。同时也存在有芽孢杆菌属（Bacillus）、微球菌属（Micrococcus）、埃希氏菌属（Escherichia）、黄杆菌属（Flavobacterium）、肠杆菌属（Enterobacter）、产碱杆菌属（Alcaligenes）等。在牛乳房表面、不清洁的挤乳器内和运送牛乳的无缝不锈钢管道及其阀门很可能存有嗜冷菌的污染源。特别是设备停车期间，在存在污染源的部位嗜冷菌利用残存牛乳生长和大量繁殖，当设备开始运行时流经该部位的牛乳便被嗜冷菌污染。
嗜冷菌通常不耐热，原料热处理后嗜冷菌可被杀死。但是嗜冷菌可以产生蛋白酶和脂酶。嗜冷菌产生的蛋白酶无法通过单一的热处理完全灭活，即能够耐受巴氏灭菌（72℃，15s）和超高温（UHT）（120～150℃，0.5～8s）灭菌工艺处理，引起牛乳腐败变质。嗜冷菌分泌的脂酶常常是热稳定的、同时又能引起牛乳产生酸败和苦臭味。脂酶对脂类的降解不像蛋白酶对蛋白质的降解那样占有绝对优势。假单胞菌属是牛乳中降解脂类的主要菌群，同时气单胞菌属、无色杆菌属、黄杆菌属等也能分泌脂酶。不同嗜冷菌菌株分泌的脂酶耐热性能不同。黄杆菌分泌的脂酶与假单胞菌和气单胞菌分泌的脂酶相比较，前者具有较差的耐热性能。但也有研究认为牛乳中固有的脂酶可能比牛乳中的嗜冷菌产生的脂酶对牛乳及制品的质量影响更大。
牛乳和乳制品最常见的风味缺陷――水果味和酸败味，是牛乳中含有的大量的嗜冷菌对牛乳中的组成成分作用后的产物。所有的这些风味缺陷如酸败味、乳酪味、苦味、酵母味和鱼腥味等产生的原因都被研究过。嗜冷菌分泌的蛋白酶和脂酶作用于牛乳中的蛋白质和脂肪而使其分解和被嗜冷菌吸收利用。嗜冷菌所分泌的热稳定的胞外酶在牛乳中含量很低时也能水解牛乳中的蛋白质和脂肪从而引起超高温牛乳产生苦味和出现胶凝沉淀；也能引起乳制品产生臭味。
目前，我国尚无乳与乳制品中芽孢总数测定的国家标准，只有一些大型乳品企业有相关企业标准。其依据是将待检样品经低温冷冻处理后，其中残留的微生物主要是嗜冷菌。如把它接种到适宜的培养基（如结晶紫红四氮唑培养基）中，置于7℃冰箱内培养一定时间，嗜冷菌的菌落为红色，进行菌落计数，得到的数据即为待检样品中所含的嗜冷菌数。为了便于准确计数，需将待检样品做适当的稀释处理。
实验材料
（一）材料
生乳。
（二）培养基
结晶紫红四氮唑琼脂（简称CVT培养基，选择性培养基）（培养基63），或酪蛋白大豆蛋白胨琼脂（培养基64）和普通营养琼脂（非选择性培养基）（培养基4）。
（三）试剂
0.1%无菌蛋白胨水（培养基35）9mL/管；225mL/250mL三角瓶，预加玻璃珠。
（四）仪器及其他用品
45℃水浴箱、无菌平皿、无菌吸管、涂布棒、7℃冰箱、15℃培养箱等。
实验流程
样品→10倍梯度稀释→倾注平皿→低温培养→菌落计数→报告
实验步骤
（1）以无菌操作称取检样25g（或25mL），放入含有225mL无菌蛋白胨水的三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。
（2）用无菌吸管吸取1：10稀释液1mL注入含有9mL无菌蛋白胨水的试管中，即为1：100稀释液。依此类推，制成稀释倍数为1：1000和1：10000的稀释液，做一次递减稀释液换一次吸管。
（3）用无菌吸管吸取1mL 1：1000的稀释液于无菌平皿中，做两个平皿；再吸取1：10000的稀释液1mL于无菌平皿中，做两个平皿。
（4）按以上步骤，以1mL无菌生理盐水作为空白操作对照。
（5）在无菌操作条件下，在一个灭菌平皿内倾入15mL营养琼脂培养基，并暴露至接种过程结束，标记后作为环境对照品。
（6）将冷却至45℃左右的嗜冷菌培养基（最好是CVT培养基）注入平皿中，待凝固后，将平皿翻转，即保持有标记和培养基的一面朝上。
（7）将所有平皿（包括空白和环境对照）置于冰箱的保鲜室中，在4～6℃的温度下培养10d，或在15℃的温箱中培养3d，菌落计数。
实验结果与报告
（1）选择菌落数在30～300之间的平皿为标准，在菌落计数器上计数每个平皿上的菌落总数，记录在微生物检验操作表中。
（2）检验结果=平行样品菌落数总和/2×稀释倍数，记录在微生物操作表中。
（3）计数结果在100以内，按实际计数报告；100以上按两位有效数字报告。
报告方式为：每1mL（g）样品所长出的菌落数即为样品中所含的嗜冷菌数。其单位是CFU/mL（g）。
思考题
原料乳中嗜冷菌的检测应该注意哪些问题？
