一、常用简易保藏菌种的方法
实验目的
（1）了解几种保藏菌种的基本原理。
（2）掌握几种常用的微生物菌种保藏的方法。
实验原理
菌种保藏的原理是人工创造一个低温、干燥、缺氧、缺乏营养素及添加保护剂等环境条件，将微生物的新陈代谢作用限制在最低范围内，生命活动基本处于休眠状态，而又使菌种达到不变异和不死亡。此外，若要达到长期保藏菌种的目的还必须选用典型优良纯培养物，并尽量采用其休眠体（如细菌的芽孢、真菌的孢子等）与尽量减少传代次数。菌种保藏方法很多，有简易的斜面划线或半固体穿刺低温保藏法、液体石蜡保藏法、甘油保藏法、沙土管保藏法，以及复杂的冷冻真空干燥保藏法、液氮超低温保藏法等。
（一）斜面低温保藏法和半固体穿刺保藏法
将在斜面或半固体培养基上生长健壮的培养物置于4℃冰箱中保藏，定期移植。此法是利用低温抑制微生物的生长。优点是不需特殊设备，操作简便易行，被实验室和工厂菌种室广泛采用。缺点是保藏时间短，菌种传代次数较频，遗传性状易发生变异和衰退。此外，棉塞长霉易引起菌种污染。保藏时间依菌种不同而异。霉菌、放线菌和有芽孢细菌可保存3～6个月，酵母菌2～3个月，无芽孢细菌1～3个月。半固体穿刺保藏法一般可保藏菌种半年至一年。
（二）液体石蜡保藏法
在新鲜斜面培养物上覆盖一层灭菌液体石蜡，置于4℃冰箱中保藏。液体石蜡有隔绝空气作用，又防止培养基的水分蒸发，故此法是利用缺氧和低温双重抑制微生物生长。优点是操作简单易行，保存期较长。缺点是必须直立保存，不便携带。保藏时间依菌种不同而异。霉菌、放线菌和有芽孢细菌保存2年以上，酵母菌1～2年，无芽孢细菌1年左右。
（三）沙土管保藏法
将待保藏菌种接种于斜面培养基上，经培养后制成孢子悬液，将孢子悬液滴入灭菌沙土管中，孢子即吸附在沙子上，将沙土管置于真空干燥器中，吸干沙土管中水分，经密封后置于4℃冰箱中保藏。此法是利用干燥、缺氧、缺乏营养素、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间，可保藏菌种1年到数年。
（四）甘油保藏法
在液体新鲜培养物中加入适量（一般用量为15%～50%）的灭菌甘油，置于-20℃冰柜或-70℃超低温冰柜中保藏。此法是利用甘油作为保护剂，甘油透入细胞后，能强烈降低细胞的脱水作用，同时在低温冷冻条件下，可大大降低细胞代谢水平，从而达到延长保藏时间的目的。此法可保藏菌种半年到一年。
（五）液氮超低温保藏法
将微生物细胞直接或离心浓缩后悬浮于液体培养基中或含保护剂的液体培养基中，或者将带菌琼脂块直接浸没于含保护剂的液体培养基中，直接放入-80℃超低温冰柜中保藏，或经缓慢冷冻后，再转移至液氮冰箱内，于液相（-196℃）或气相（-156℃）中保藏。
每种保藏方法都有其适用范围，要根据被保藏菌种的特性选择适宜的保藏方法。如有的微生物不耐冷，可采用真空干燥保藏法而不选择冷冻真空干燥保藏法；有的不耐干燥，则最好不选择沙土管保藏法。
实验材料
（一）菌种
待保藏的细菌、放线菌、酵母菌和霉菌。
（二）培养基
牛肉膏蛋白胨斜面和半固体深层培养基（培养细菌）（培养基4）、麦芽汁斜面和半固体培养基（培养酵母菌）（培养基26）、高氏1号琼脂斜面（培养放线菌）（培养基1）、PDA斜面培养基（培养霉菌）（培养基27）、LB液体培养基（培养细菌）（培养基2）。
（三）试剂
无菌水、无菌液体石蜡、10%HCl溶液、河沙、黄土、无菌甘油（丙三醇，AR）、五氧化二磷或无水氯化钙。
（四）仪器与其他用品
接种环、接种针、无菌滴管、无菌吸管（1mL、5mL）、10mm×100mm小试管、带螺口盖和密封圈的无菌试管或1.5mL无菌离心管、100mL的三角瓶、40目与100目筛子、高压灭菌锅、冰箱、火焰封口器（液化气火焰喷枪）等。
实验步骤
（一）斜面低温保藏法（适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的保藏）
1.贴标签
将注有菌株名称和日期的标签贴于试管斜面的正下方。
2.接种
将待保藏的不同菌种以划线接种法移接至适宜的斜面培养基上。
3.培养
细菌置37℃培养1～2d，酵母菌置25～28℃培养2～3d，放线菌和霉菌置28℃分别培养5～7d和3～5d。须用健壮的细胞或孢子作为保藏菌种。例如，细菌和酵母菌应采用对数生长期后期的细胞，不宜用稳定期后期的细胞（因该期细胞已趋向衰老），对有芽孢的细菌、放线菌和霉菌则宜采用芽孢和成熟的孢子保存。
4.保藏
将培养好的菌种置于4℃冰箱中保藏。保存温度不宜太低，否则斜面培养基因结冰脱水而加速菌种的死亡。必要时用固体石蜡熔封管口外的棉塞，以防止棉塞受潮长霉菌及培养基水分蒸发，延长保存时间。
（二）半固体穿刺保藏法（适用于兼性厌氧细菌和酵母菌的保藏）
1.贴标签
将注有菌株名称和接种日期的标签贴于半固体深层培养基试管上。
2.接种
将待保藏的不同菌种以穿刺接种法移接至适宜半固体深层培养基中央部分，注意不要穿透底部。
3.培养
与斜面低温保藏法相同。
4.保藏
将培养好的菌种置于4℃冰箱中保藏。必要时用浸有石蜡的无菌软木塞或橡皮塞代替棉花塞并塞紧。
（三）液体石蜡保藏法（适用于酵母菌、霉菌和放线菌的保藏）
1.无菌液体石蜡制备
选用优质中性液体石蜡（相对密度0.865～0.890）装入100mL的三角瓶内，每瓶装10mL，塞上棉塞，外包牛皮纸，0.1MPa灭菌30min后，置于105～110℃的烘箱内干燥2h，以除去液体石蜡中的水分，经无菌检查后备用。
2.接种、培养与保藏
将菌种划线接种于适宜斜面培养基上，在适宜温度下培养，使其充分生长。用无菌吸管吸取无菌液体石蜡注入到已长好菌的斜面上，液体石蜡的用量以高出斜面顶端1cm左右为准，使菌种与空气隔绝，直立于4℃冰箱或室温下保藏。保藏到期后，传代移种时，将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，将菌种转接至新的斜面培养基上，培养后加入适量灭菌液体石蜡，再行保藏。在移种时应尽可能去掉液体石蜡，以免影响菌种生长。
（四）沙土管保藏法（适用于产芽孢的芽孢杆菌、梭菌与产孢子的放线菌和霉菌的保藏）
1.无菌沙土管制备
取河沙若干，用40目筛子（孔径为0.42mm）过筛，除去大的颗粒，再用10%HCl溶液浸泡（用量以浸没沙面为度）除去有机杂质。浸泡2～4h（或煮沸30min）后，倒出盐酸，用自来水冲洗至中性，烘干。另取非耕作层的贫瘠（不含腐殖质）黄土若干，磨细，用100目筛子（孔径为0.149mm）过筛。将土和沙按1：4或1：3比例混合均匀，装入小试管（10mm×100mm）中，装量约1cm高即可，塞上棉塞，0.1MPa灭菌1h，每天一次，连灭3d。将灭菌沙土管按1/10进行抽样检查。用接种环取少许沙土接入牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃培养24h，观察有无杂菌生长。如果培养液长菌，则应全部重新灭菌。
2.制备菌悬液
将菌种划线接种于适宜斜面培养基上，在适宜温度下培养，得到健壮的菌体细胞或丰满的孢子。用无菌吸管吸取3～5mL无菌水加至1支菌种斜面试管中，用接种环轻轻搅动培养物，制成菌悬液。
3.加样与干燥
用无菌吸管吸取菌悬液，在每支沙土管中滴加5滴左右菌悬液，以管内的沙土全部湿润为宜，塞上棉塞，振荡混匀后，置于预先放有五氧化二磷或无水氯化钙的干燥器内。当五氧化二磷或无水氯化钙因吸水变成糊状时，应及时更换。如此数次，沙土管即可干燥。也可将干燥器连接真空泵连续抽气3～6h，抽干时间越短越好，以沙土呈分散状态为准。
4.抽样检查
将抽干的沙土管按1/10进行抽样检查。用接种环取少许沙土接种到适合于所保藏菌种生长的斜面上，进行培养，观察所保藏菌种的生长及有无杂菌生长情况。
5.保藏
检查合格后用以下方法保藏：
（1）沙土管继续放入干燥器中，置于室温或冰箱中。
（2）将沙土管带塞一端浸入熔化的石蜡中，密封管口。
（3）用火焰封口器将沙土管的棉塞下端的玻璃烧熔，熔封管口，置4℃冰箱中保藏。
（五）甘油保藏法（适用于细菌保藏）
1.无菌甘油制备
将丙三醇（甘油，glycerol）置于100mL的三角瓶内，每瓶装10mL，塞上棉塞，外包牛皮纸，0.1MPa灭菌20min后，置于40℃温箱中2周，蒸发除去甘油中的水分，经无菌检查后备用。
2.接种、培养与保藏
挑取一环菌种接入LB液体培养基试管中，37℃振荡培养至充分生长。用无菌吸管吸取0.85mL培养液，置入一支螺口冻存管，或一支1.5mL的离心管中，再加入0.15mL无菌甘油，封口，振荡混匀；对于斜面培养物，刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与甘油混匀后加入冻存管内。注意：甘油使用浓度为10%～20%（一般采用15%左右），不宜过浓，否则反而会伤害菌体。然后将其置于乙―冰或液氮中速冻。将冻存管做好标记（菌号、冻存日期等）并放入纸质或塑料冷冻盒中，最后将已冰冻含甘油的培养物置-70℃超低温冰柜抽屉中或-20℃低温冰柜中保藏。置入低温冰箱保存。抽查菌种存活情况，并定期复核与补充保藏。
3.复苏
保藏到期后，用接种环从冻结的表面刮取培养物，接种至LB斜面上或LB液体培养基中，37℃培养48h，待长出菌体或出现混浊现象即可继续使用。
实验结果与报告
（1）列表说明5种常用简易方法的保藏原理，适合保藏微生物类型、保藏温度、保藏时间，比较优缺点。
（2）菌种保藏到期后，将菌种活化检查保藏结果。
思考题
（1）简述微生物菌种保藏的一般原理。
（2）实验室中最常用哪一种简便方法保藏细菌？
二、乳品发酵剂菌种的冷冻真空干燥技术
实验目的
（1）了解冷冻真空干燥保藏法的原理。
（2）掌握乳品发酵剂菌种冷冻真空干燥方法。
实验原理
冷冻真空干燥保藏法是将加入一定保护剂（如10%～20%脱脂牛乳）的菌悬液注入安瓿管中，在极低温度下（-70℃左右）快速冷冻，然后在细胞冻结状态下真空干燥，使微生物细胞处于休眠状态（暂时停止微生物的生长和一切酶的作用），细胞的结构与成分保持不变。在冷冻干燥过程中，为防止因冷冻和水分不断升华对细胞的损害，采用保护剂来制备细胞悬液，使其在冻结和脱水过程中，保护性溶质通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分和结构。此法综合利用了各种有利于菌种保藏的条件（低温、干燥、缺氧和添加保护剂等），是目前最有效的菌种保藏方法之一，广泛适用于细菌（有芽孢或无芽孢的）、放线菌、酵母、产孢子霉菌以及病毒。其保藏期可达一年至十几年，且存活率高、变异率低；缺点是所需设备昂贵，操作复杂。本实验以冻干乳品发酵剂菌种为例介绍其保藏方法。
发酵剂菌种的保藏对生产至关重要，乳品生产上常用最有效的冷冻真空干燥方法保藏发酵剂菌种。其原理是水的三种相态（固态、液态、气态）达到平衡时必有一定的条件，这种条件称为相平衡关系。水的相平衡关系是分析含水细胞冷冻干燥原理的基础，根据热力学中相平衡理论，水的三相点温度为0.0098℃，三相点的压力为609.3Pa，在发生相变过程中，当压力低于三相点的压力时，固态水直接转化为气态的水蒸气。因此，冷冻真空干燥是将含水量大的物质预先冷冻为固态，然后在真空条件下使物质中的冰晶直接升华为气态，待冰晶升华后再除去物质中的部分吸附水，最后得到含水分很少的干制品。
实验材料
（一）菌种
德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp。bulgaricus）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、乳酸乳球菌乳脂亚种（Lacococcus lactis subsp。cremoris）37℃，培养8～12h的脱脂乳试管培养物。
（二）培养基
MRS斜面培养基（培养基14）、M17斜面培养基（培养基15）、12%～15%的脱脂乳培养基（培养基18）。
（三）试剂
2%HCl溶液。
（四）仪器与其他用品
试管、洗瓶、安瓿管（或西林瓶）、无菌长颈毛细滴管或长注射器针头、冰箱、6L冷冻真空干燥机（美国LABCONCO公司）、离心机、火焰封口器（液化气火焰喷枪）、空气泵等。
实验流程
准备安瓿管→制备菌悬液→分装安瓿管→预冻→冷冻真空干燥→真空封口→保藏
实验步骤
（一）准备安瓿管
安瓿管采用内径8mm，长度为110mm的玻璃管，材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡8～10h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏水浸泡至pH中性，最后烘干备用。干燥后贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15～20min，备用。
冻干用西林瓶体的处理同安瓿管，胶塞应用自来水冲洗多次，用蒸馏水浸泡至pH中性。瓶体与胶塞分开，用121℃下高压灭菌15～20min，备用。西林瓶上的铝盖用75%的酒精浸泡8h，烘干备用。
（二）菌悬液的制备
将脱脂乳试管培养物分别划线接种于MRS斜面培养基（杆菌）与番茄汁斜面培养基（球菌）上，于37℃培养36～48h至斜面长出健壮的菌苔，进行纯度检查后，将培养好的菌种斜面培养物分别加入12%脱脂乳保护剂2～3mL，用接种环轻轻刮下培养物，制成108～1010个/mL菌悬液（以乳杆菌为例，为了取得每1mL1010个活细胞菌液2～2.5mL，只需10mL琼脂斜面两支）。
（三）分装安瓿管
采用较长的无菌毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，每管分装量0.1～0.2mL，若是球形安瓿管，装量为半个球部并用棉花塞于安瓿管末端（注意：勿使菌悬液沾到管壁上，而要直接滴入安瓿管的底部）。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1～2h内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。
西林瓶的分装可采用灭菌移液管进行，但要严格无菌操作，装悬液完毕后，应半盖瓶塞（保证升华），迅速移入冻干机舱。
（四）预冻
预冻的目的是使菌悬液在低温条件下冻结成冰，使水分在冻结状态下升华，以免在真空干燥时菌悬液沸腾，发生气泡而外溢。将装有菌悬液的安瓿管直接放在低温冰柜中（-45～-35℃），或置于-70～-30℃的CO2干―水乙醇浴中预冻。也可在附有冻结舱的冻干机中进行。预冻温度范围在-40～-25℃，一般采用-35℃预冻1h。于-80～-70℃超低温冰柜中预冻效果亦良好（注意：预冻温度不要超过-25℃）。否则因含有脱脂牛乳的菌悬液冰点下降，冻结不结实，影响升华干燥而易失败。
（五）冷冻真空干燥
1.方法一
（1）自动运行 在LABCONCO冷冻真空干燥机上，按下AUTO键开启制冷压缩机，自动运行程序开始启动，AUTO键上面的压缩机指示灯点亮，冷阱温度开始下降，当达到-40℃后，冷阱温度指示灯由黄色变为绿色，此时真空泵开始自动启动，真空度开始下降，屏幕显示实际真空度。当真空度＞0.200MPa时，显示HI；当真空度为0.200～0.045MPa时，指示灯为黄色，并相应顺序点亮；当真空度接近0.0133MPa时，指示灯为绿色闪亮；当真空度≤0.0133MPa时，指示灯为稳定的绿色，此时可以加样。
（2）加样 将预冻后的1支菌种安瓿管接到LABCONCO冷冻真空干燥机多歧管上（事先将48支多歧管口用塑料帽塞好，使系统不漏气），在拔掉多歧管上塑料帽接上安瓿管的过程中，系统的真空度回升。待真空度重新恢复到0.0133MPa时，再加第2支菌种安瓿管，重复以上操作，将安瓿管一个个全部连接于48支多歧管上（注意：加样过程要保证足够低的冷阱温度和真空度，防止预冻样品熔化）。
（3）冻干加样完毕，于0.0250～0.0133MPa真空度、冷阱温度-50℃条件下进行升华干燥。当安瓿管表面不再有冰霜和凉的感觉时，样品接近干燥，再继续冻干2～3h。干燥后样品呈白色疏松状态，稍一振动即脱离管壁。
终止干燥时间应根据下列情况判断：
●安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状。
●在正常操作中，保持抽真空状态，关闭大蝶阀，观察真空表指针，如发现指针在0～8Pa之间，并且保持基本不变，证明已经干燥。
●真空度接近空载时的最高值。
●样品温度与管外温度接近。
●选用1～2支对照管，其水分与菌悬液同量，视为干燥完结。
●选用一个安瓿管，装1%～2%氯化钴，如变深蓝色，可视为干燥完成。
冷冻干燥完毕后，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。
注意：将预冻样品接到多歧管上时，因真空度的回升，易使样品熔化，而易将液体抽到真空泵的油中。因泵油带水，使真空泵不能正常工作。真空度很难下降。因此，上样品时。一定要时刻注意样品是否熔化。对熔化的样品应立即卸下，重新预冻。防止内容物吸入真空泵的油中。
2.方法二
将装有已冻结菌悬液的安瓿管放入冻干机真空干燥箱内，真空箱温度控制在-20℃以下开动真空泵，15min内应使真空度达到0.0667MPa。在此条件下，菌悬液才能保持冻结状态，冻结的样品开始升华，继续抽气，当真空度达到0.0267～0.0133MPa后，一般维持6～8h样品即被真空升华干燥。当真空度达到0.0267MPa时或样品中大部分水分升华后也可以逐渐升高真空箱温度至25～30℃，加速样品中残留水分的升华。当冻干菌中的含水量达到1.5%～3.0%时，干燥结束（若高于3%需继续干燥）。一般少量样品干燥时间为6～8h，大量样品需10～12h。
（六）真空熔封及真空度检测
1.直接真空熔封
冻干结束，在保持0.025MPa真空度的条件下，直接在冻干机的多歧管架上用连接空气泵的液化气火焰（蓝色细火焰）在安瓿管的细颈处熔封。在熔封过程中，如果只烧一处应熔封的部位，因安瓿管内部处于真空状态，就会内陷成一小窝甚至容易烧漏，故必须将手持的火焰封口器转圈均匀接触安瓿管，待玻璃烧软后，再将安瓿管慢慢拉长，同时熔封。最后，再使熔封部分接触弱火焰回火，火焰勿太强烈，否则熔封部分发生变形，冷却后或在保藏期间会出现裂缝，影响保藏效果。
熔封完毕，拔掉多歧管上熔断安瓿管剩余的玻璃管，或拔掉冷阱排液管的胶塞，卸掉真空，先按VACUUM键关闭真空泵，再按AUTO键关闭制冷压缩机，最后关闭电源开关。
注意：关机前若没有卸真空而直接将真空泵关闭或总电源突然出现断电，将出现真空泵油逆抽的现象，造成泵油将样品、管路、真空探头等污染，亦造成真空泵的损坏。
2.间接真空熔封
样品干燥后，先将安瓿管内的棉塞向下推移，然后在棉塞下端处用火焰烧熔并拉成细颈，再将安瓿管安装在封口用的抽气装置的多歧管上。开启真空泵，室温下抽气，当真空度达到0.0267MPa时，继续抽气约10min后，用火焰在细颈处烧熔、封口。
3.真空度检测
熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。密封后瓶中是否保持着真空，可用高频率电火花发生器测试，如果电火花通过安瓿管或西林瓶呈现淡紫色或白炽色，证明保持着真空，如果呈蓝紫色，证明失去真空度。经真空检测后，西林瓶上加消毒的铝盖，用压盖器压盖。
（七）保藏
将合格的安瓿管或西林瓶置于4℃冰箱中低温避光保存。
（八）质量检查
冷冻干燥后抽取若干支安瓿管或西林瓶进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。因此冻干样品的实际数量要多于所需样品的数量。
（九）复苏培养
1.安瓿管（瓶）的操作
（1）先用70%酒精棉花擦拭安瓿管上部。
（2）将安瓿管顶部烧热。
（3）用无菌棉签蘸冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用锉刀或镊子在颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端。
（4）加少量（一般0.5mL）无菌生理盐水或培养该菌株所适宜的液体培养基，将冻干物再溶化，通常称为复水或再水化（rehydration），待全部溶化后将此液轻轻摇动，使重新悬浮。
（5）用接种环将悬液移植于该菌所适宜的斜面培养基上，或在该成分培养基平板上划线，于适温下培养。如果保存的时期已久，可能其中存活的细胞数减少，为此可将复水后的悬浮液全部倾入斜面上或平板上进行培养。
2.西林瓶的操作
（1）先用70%酒精棉花擦拭冻干的铝盖上部，以70%酒精消毒后的剪子剥去铝盖。
（2）对胶塞及西林瓶口周围进行消毒。
（3）移灭菌的镊子。
以下同“安瓿管瓶的操作”（4）、（5）。
实验结果与报告
用标准平板活菌计数法检验发酵剂菌种低温冷冻干燥后的存活率。
思考题
（1）简述冷冻真空干燥保藏法的原理及其突出优点。
（2）制备菌悬液过程中为什么要加入保护剂？
（3）在冷冻真空干燥保藏法中为什么必须先将菌悬液预冻后才能进行真空干燥？
§§第二章 乳品微生物学应用实验技术
