一、概述
微生物培养亦称微生物发酵，发酵生产按微生物培养工艺不同可以分为固态发酵和液态发酵两种类型。两者在工艺过程上大体相同，主要工艺过程为：
斜面菌种培养→菌体或孢子悬浮液制备→种子扩大培养→发酵培养→发酵产物与发酵基质分离→提纯与精制→成品
固态发酵是将微生物接种到经过处理的固体发酵基质上，或将发酵原料及菌体吸附在疏松的固体支撑物上，通过微生物的代谢活动，使发酵原料转化成发酵产品。采用固态发酵工艺所需设备简单，不需要结构复杂的发酵罐；操作方法简单，能耗较低，不需要大量的通风和搅拌。但是固态发酵不宜采用自动化控制，劳动强度较大，生产率较低。液态发酵是将物料首先制备成液态，再将微生物接入进行发酵。液态发酵容易实现自动化生产，生产效率高。
深层培养可分为分批培养、流加培养、半连续培养、连续培养和灌注培养五种方式，不同的操作方式具有不同的特征。以发酵方式可分为分批发酵（间歇发酵）、补料分批发酵和连续发酵等。
在发酵生产中采用何种培养方式应视生产所用微生物的生长特性、代谢特性及发酵动力学等因素综合考虑。如发酵基质浓度对微生物的生长和代谢有抑制作用，应采用流加培养方式，以消除高底物浓度对发酵的影响。
（一）分批培养
分批培养又称为分批发酵，是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。该方法在发酵开始时，将微生物菌种接入已经灭菌的培养基中，在微生物最适宜的培养条件下进行培养，在整个培养过程中，除氧气的供给、发酵尾气的排出、消泡剂的添加和控制pH需加入的酸或碱外，整个培养系统与外界没有其他物质的交换。分批培养过程中随着培养基中的营养物质的不断减少，微生物生长的环境条件也随之不断变化，因此，微生物分批培养是一种非稳态的培养方法。
分批培养将细胞和培养液一次性装入反应器内，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成，经过一段时间反应后，将整个反应系取出。
在分批培养的操作中，由于底物消耗和产物形成，细胞所处的环境时刻都在发生变化，不能使细胞自始至终处于最优条件下。从这个意义上讲，分批培养并不是一种好的操作方式。但是分批培养的特点是操作简单，易于掌握，因而是最常见的操作方式。
（二）流加培养
流加培养又称为补料分批培养，是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜的条件下接种细胞，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成。随着细胞对营养物质的不断消耗，向反应器中不断补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，到反应终止时取出整个反应系。流加培养是介于分批培养过程与连续培养过程之间的一种过渡培养方法。目前补料分批培养已在发酵工业上普遍用于氨基酸、抗生素、维生素、酶制剂、单细胞蛋白、有机酸以及有机溶剂等的生产过程。目前补料分批发酵的类型很多，就补料的方式而言，有连续补料、不连续补料和多周期补料；每次补料又可分为快速补料、恒速补料、指数速度补料和变速补料；按反应器中发酵液体积区分，又有变体积和恒体积之分；从反应器数目分类又有单级和多级之分；从补加的培养基成分来分，又可分为单一组分补料和多组分补料。
流加培养的特点就是能够调节培养环境中营养物质的浓度。一方面，它可以避免某些营养成分的初始浓度过高而出现底物抑制现象；另一方面，能防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成，这是流加培养与分批培养的明显不同。由于新鲜培养液的加入，整个过程中反应体积是变化的，这是它的一个重要特征。
根据不同情况，存在不同的流加方式。从控制角度可分为无反馈抑制流加和有反馈抑制流加两种。无反馈抑制流加包括定量流加和间断流加等。有反馈抑制流加，一般是连续或间断地测定系统中限制性营养物质的浓度，并以此为控制指标，来调节流加速率或流加液中营养物质的浓度等。
（三）半连续培养
半连续培养又称为反复分批培养或换液培养，是指在分批培养的基础上不全部取出反应系，剩余部分重新补充新的营养成分，再按分批培养的方式进行操作。这是反应器内培养液的总体积保持不变的操作方式。这种操作方式可以反复收获培养液，对于培养基因工程动物细胞分泌有用产物或病毒增殖过程比较适用。例如，采用微载体系统培养基因工程rCHO细胞，待细胞长满微载体后，可反复收获细胞分泌的乙肝表面抗原（HBsAg）制备乙肝疫苗。
（四）连续培养
连续培养是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的量维持恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态下生长的微生物发酵培养方式。连续培养又称连续发酵，它与封闭系统中的分批培养方式相反，是在开放的系统中进行的培养方式。在连续培养过程中，微生物细胞所处的环境条件，如营养物质的浓度、产物的浓度、pH以及微生物细胞的浓度、比生长速率等可以自始至终基本保持不变，甚至还可以根据需要来调节微生物细胞的生长速率，因此连续培养的最大特点是微生物细胞的生长速率、产物的代谢均处于恒定状态，可以达到稳定、高速培养微生物细胞或产生大量的代谢产物的目的。此外，对于细胞的生理或代谢规律的研究，连续培养是一种重要的手段。
连续培养过程可以连续不断地收获产物，并能提高细胞密度，在生产中被应用于培养非贴壁依赖性细胞。如英国Celltech公司采用连续培养杂交瘤细胞的方法，连续不断地生产单克隆抗体。
（五）灌注培养
灌注培养是指细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断加入反应器，另一方面又将反应液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。
当高密度培养动物细胞时，必须确保补充给细胞足够的营养以及去除有毒的代谢废物。在半连续培养中，可以采用取出部分用过的培养基和加入新鲜的培养基的办法来实现。这种分批部分换液办法的缺点在于当细胞密度达到一定量时，废代谢物的浓度可能在换液前就达到产生抑制作用的程度。降低废代谢产物的有效方法就是用新鲜的培养基进行灌注，通过调节灌注速率可以把培养过程保持在稳定的、废代谢物低于抑制水平的状态下。一般在分批培养中密度为（2～4）×106cells/mL，在灌注系统中可达到（2～4）×107cells/mL。灌注技术已经应用于许多不同的培养系统中，规模分别为几十升至几百升。
二、分批培养
分批培养就是一次性收获产品的操作。分批培养的优点是：培养基一次灭菌，一次投料，容易实现无菌状态；易于操作控制，产品质量稳定；培养浓度较高，易于产品分离。但是分批培养的辅助时间较多，设备生产能力低。在目前国内外绝大多数发酵生产中，都是采用分批培养的方法。
根据培养基的添加方式不同，分批培养又可分为一次性投料的一般分批培养和连续添加培养基的流加培养。
一般分批培养是指一次性投料和一次性回收产品的操作。在这种操作方法中还包括下列两种情况。
一是在有些发酵操作中，微生物生长和代谢所需的某些营养成分可能需连续供应。例如好氧培养中微生物所需的氧气就必须连续供应，这是因为氧在培养液中的溶解度很小，不可能在发酵开始时一次供足。又如在许多发酵生产中，氮源和碳源的加入也往往采用连续流加的方法。氮源的流加可能有两方面的原因，一是为了控制微生物的生长；二是当使用氨水、硫铵等碱性氮源时，采用流加的方法有利于pH的调节。谷氨酸发酵中，氮源的加入就是采用连续流加的方法。磷源的流加也有两个原因，一是可能有利于pH的调节控制；另一个原因是若在发酵开始时一次性投入磷酸，则磷酸根离子可能会与培养液中某些金属离子结合而沉淀，影响培养过程后期微生物的吸收和利用。
第二种情况是重复批式培养。所谓重复批式培养就是当培养成熟后，只分出一部分成熟醪，在原反应器中，留一部分成熟醪作为种子，接入新鲜培养基后继续培养。这种操作方法多见于种子培养阶段，如我国大多数酒精厂的酒母车间一般都采用这种操作。这种培养方法省去了前几级种子培养，节约了人力物力，但长期的重复批式培养会使菌种产生退化变异，影响后面工段的生产。因此，重复一定的次数后，就必须重新从菌种开始培养。
在分批培养过程中，微生物的生长一般可分为延滞期（lag phase）、对数生长期（logarithmic growthphase）、减速期（fransient phase）、稳定期（station-ary phase）和衰退期（decline phase）五个阶段。
在延滞期，细胞不生长。延滞期的长短，差别很大，短的几乎觉察不到，而长的要在接种后2～3d才开始生长。延滞期的长短与接种条件有很大的关系。种子老化会使延滞期延长，而在对数生长期接种延滞期最短。其次，带培养液接种比种子经分离培养液后接种的延滞期要短，但带培养液的种子易老化，不易保藏。对于经分离后的浓缩种子，若在接种时添加适量的培养滤液，则可缩短延滞期。此外，对有些微生物培养在接种时添加某种激活剂可大大缩短延滞期。例如，用最小培养基（碳源为葡萄糖）培养Aerobacter aerogenes时，延滞期显著地受培养基中Mg2+浓度的影响。Mg2+是磷酸酯酶的激活剂，Mg2+不足，影响与核酸合成等有关的反应，因而延长延滞期。在延滞期完成了细胞合成的准备工作后，就进入迅速生长的对数生长期。在此时期内，细胞的生长速率与细胞浓度成正比。在减速期，细胞的增长速率逐渐减慢；至稳定期后，细胞浓度不再增加。这时就必须考虑放罐，否则将会出现菌体自溶、细胞浓度下降的衰退期。
应该指出，在上述各方程式中只考虑了底物的消耗，而没有考虑其他环境条件的变化，因而与实际的发酵生产存在一定的误差。式（6-59）、（6-63）和（6-64）一般只适合于对数生长期及减速生长期，特别是式（6-64）仅适合于生长联系型模式（见产物形成动力学）。
稳定期和衰退期的出现，除了底物浓度下降或已被耗尽外，一般认为还有下列原因。
①其他营养物质不足：除碳源外，其他必须营养物质不足，同样会引起微生物停止生长，进入稳定期和衰退期。
②氧的供应不足：随着培养液细胞浓度的增加，需氧速率越来越大，而培养液中菌体浓度的增加，导致黏度增大，溶氧困难，因而在分批培养的后期，容易造成供氧不足。供氧不足会造成细胞生长速率减慢，严重时会出现菌体自溶，进入衰退期。
③抑制物质的积累：随着微生物的生长，培养液中各种代谢产物的浓度逐渐增高，而有些代谢产物对微生物本身的生长有抑制作用。
④生物的空间不足：据经验，在培养细菌及酵母等时，当细胞浓度达到109～1010个/mL时，培养液中还有充足的营养物质，但菌体的生长几乎停止。这种现象的出现有人认为是由生长抑制物质所引起，可是也有人认为是由于单个细胞必须占有最小的空间所致。
三、流加培养
流加培养亦是一种批式操作，与一般分批培养的不同点在于营养物不是一次加入，而是在培养过程中按预定速率或根据培养过程的检测连续流加营养物。流加培养一般出现在下列两种情况中：一种情况是培养过程中的主要底物是气体；另一种情况是存在底物抑制。若底物是气体，如甲烷发酵，则不可能将底物一次加入，只能在培养过程中，连续不断地通入。对于存在底物抑制的培养系统，采用连续流加培养基的方法，可使发酵液中一直保持较低的底物浓度，从而解除底物抑制。目前国内外的酵母生产行业大多采用这种操作方法。
酵母的生产与代谢不仅取决于是否有足够的氧，而且与糖的含量有关。当糖含量很低时（0.028%），在有氧条件下，酵母不产生乙醇，其生长得率可达50%；当糖含量较高时，酵母菌在生长的同时，产生部分乙醇，酵母得率低于50%；而当培养液中的糖含量达5%时，即使在有足够氧的条件下，酵母菌的生长也会受到抑制，且产生大量乙醇，酵母得率很低。因此，为了获取较高的生长速率和较高的酵母得率，必须使培养液中糖的含量保持在较低的水平。显然，采用一次投料的方法是不行的，这样在发酵的初始阶段将会产生大量酒精，影响酵母的生长和收得率。采用流加的方法可获得满意的结果，在整个发酵过程中，培养液中的糖含量都保持在较低的水平（一般为0.1%～0.5%），酵母利用多少就流加多少，流加速率等于酵母的耗糖速率。这样酵母处在较低糖含量的培养条件下，以较快的速度生长，其酵母的收得率也能取得令人满意的结果（Yx/S=0.4～0.45g/g），这就是酵母培养采用流加培养的原因。
对流加培养过程进行物料衡算（忽略细胞死亡）：
同样，在上述方程式中没有考虑环境条件的变化。若根据上述方程，在反应器容积不受影响的情况下，流加培养过程可无限延长，而细胞浓度的极限值为xmax=Yx/SSF。事实上，这是不可能的。流加培养过程由于同样受氧的供应、抑制物质的积累、生物空间的不足以及菌种老化等多种原因的影响，同一般分批培养一样会出现减速期、稳定期和衰退期。式（6-65）～（6-73）一般只适合于流加培养的前期和中期。
四、连续培养
连续培养是在微生物培养系统中连续添加培养基的同时连续收获产品的操作。在连续操作中，反应器中的底物浓度和细胞浓度都保持不变。与分批培养比较，连续培养具有设备生产能力高、易于实现自动控制和劳动生产率高等优点，主要的缺点是很难保证长期的无菌操作和培养浓度较低。因此，连续培养很难在无菌要求极严格的发酵生产中实现。其次，对于产品不易分离的发酵生产也不宜采用连续培养。
（一）连续培养模型
连续培养分全混式（COST）和活塞流式（PFR）两种。所谓全混式反应器是一种理论模型，其基本假设有：
①进料液和出料液流量相等，容器中液体的体积V恒定；
②反应器中底物、产物和细胞的浓度均匀一致，即反应器中无浓度梯度；
③流出液中的物料组成等于反应器中的物料组成。
活塞流式是另一种模式的连续培养，其基本假设有：
①物料遵循严格的先进先出，像活塞一样；
②细胞浓度和营养物组分的浓度沿反应器轴向逐渐变化，但沿径向方向无浓度梯度；
③反应器各处，各组分的浓度不随时间变化。
根据达到稳定状态的情况，全混式反应器分恒化器和恒浊器两种。
恒化器是指达稳定态时，反应器的化学环境恒定。在恒化器法的连续培养中，通常是通过限制某些化学物质的量（如以碳源或氮源作为限制基质）来控制微生物生长。在连续培养时，既可以采用一种限制基质，也可以采用两种限制基质。生长所需的任何一种营养物都可以作为限制生长的营养组分，这样为研究者通过调节生长环境来控制正在生长的细胞生理学特性提供相当大的灵活性。
恒浊器是指达稳定态时，反应器中的细胞浓度恒定。在恒浊器法连续培养中，通常是通过控制培养液的混浊度来保持恒定的细胞浓度，因而得名恒浊器。目前，通过测定pH、CO2等进行控制的培养方式被解释为广义上的恒浊培养。在恒浊器培养中，所供给的营养组分都必须是过剩的，这样才能保持稳定的生长速率。
在连续培养的过程中，被广泛应用的是恒化器，而恒浊器在连续培养中应用较少，一般用于光合微生物（如小球藻）的培养。
就一般的连续培养而言，连续培养过程的稳定条件包括两个方面，一是流量和培养液体积的稳定，二是反应器中各物质浓度的稳定。在稳定的连续培养中，所有物质的浓度都是恒定的。然而，稳定的建立一般是指通过某种限制基质来进行的，即用限制基质来控制微生物的生长。当限制基质的供应和菌体的生长达到平衡时，即达稳定态。
下面只讨论全混式反应器连续培养的基本理论。在全混式反应器中，根据连续培养的级数（即串联反应器的个数）可分为单级连续培养、二级连续培养和多级连续培养。
（二）单级连续培养
1.单级连续培养的物料衡算
D称为稀释率，它表示连续培养过程中单位液体体积的进料速率，其单位是时间的倒数，常以1/h表示。
可知，对于稳定的连续过程，稀释率等于比生长速率，根据此原理可测定微生物的比生长速率。
在连续培养条件下，改变稀释率D，在达到另一个稳定态时，即有一个确定的底物浓度S。根据一系列的（D，S）值，即可用作图法求得μmax和KS值。
2.稀释率对生长得率的影响
基质生长得率Yx/S在一定条件下是一个常数，其值随菌种和培养条件不同而异。在连续培养中，培养条件不仅包括温度、pH、底物浓度、溶氧浓度等参数，而且还包括生长速率即稀释率。关于稀释率与生长得率的关系，一般认为在一定稀释率范围内Yx/S为一常数。而在稀释率很低或接近最大比生长速率时，Yx/S值有所下降。在稀释率很低时，生长得率有所下降是因为维持细胞生命需要一定底物的缘故。一般认为维持细胞生命所需的底物是一定的，与细胞生长速率无关。在比生长速率较高时，底物消耗速率较大，维持细胞生命所需的底物占整个底物消耗的比例很少，在计算中往往可忽略。而在比生长速率很低时，底物消耗速率亦很低，这时维持细胞生命所需底物占整个底物消耗的比例较大，因而使细胞生长得率降低。在稀释率很高而接近最大比生长速率时，发酵培养液中的底物浓度很高。在这种情况下，微生物通常产生较多的中间代谢产物，如醋酸、丙酮酸、乙醇等。中间代谢产物的大量生成，造成了底物的浪费，因而细胞得率随之降低。
3.洗出
连续培养的稳态条件需满足μ=D，当流量改变而引起稀释率D改变时，培养液中的底物浓度、细胞浓度和产物浓度随之改变。由式（6-79）～（6-82）可知，S，x，P均为稀释率D的函数。当稀释率D下降时，反应器中的底物浓度将下降，而细胞浓度和产物浓度将上升。反过来，若增大稀释率D，反应器中的底物浓度将升高，细胞或产物的浓度将下降。然而这种调节是有限度的，当逐渐提高稀释率，使反应器中底物浓度S接近于进料液中的底物浓度S0时，细胞浓度将趋于零，整个连续培养过程也就完全被破坏了。由此可知，连续过程的最大稀释率为：
当稀释率D→DC，而使反应器的细胞浓度x→0时，即被称为洗出。发生洗出时的稀释率DC被称做临界稀释率。
当S0＜KS时，
4.最适稀释率
最适稀释率并不是指连续培养过程所允许的最大稀释率，而是指使细胞或产物的生产能力达最大时的稀释率。在发酵生产中，生产能力是指单位时间培养液体积的产品量，其单位是质量/（体积？时间），一般以g/（L？h）表示。对于细胞，生产能力即为生长速率；对于代谢产物，生产能力亦称为生产速率。
由此式可知，Dm与Dc的值是比较接近的。这就是说在最大生产能力下操作，由于其稀释率接近临界稀释率，因而容易发生洗出现象。在实际操作中，所选择的稀释率应稍小于Dm。细胞浓度、底物浓度、生产能力与稀释率的关系。
5.细胞回流
对分离器进出流量进行衡算：
由此可见，采用产物浓缩后部分细胞回流，可使稀释率大于比生长速率，由于生产能力正比于稀释率，因而采用浓缩细胞部分回流后，可提高反应器的生产能力。
然而，上述细胞回流系统需要增加分离设备和动力设备，而且由于老细胞的循环会使细胞的死亡速率增大，产品质量下降，在用活性污泥处理生物废水时较为合适，这是因为：
①死细胞多，但对活性污泥来说不存在产品质量问题；
②采用细胞循环时，虽然分离设备将提高至（1+α）倍，但反应池的废水处理能力往往可提高好几倍；
③污泥部分循环可保证活性污泥不会洗出，提高操作的稳定性。
（三）多级连续培养
连续培养的特点之一是具有较高的设备生产能力。但对单级连续培养来说，在生产能力较高时，其残留底物的浓度往往较高，这样底物的浪费较大；如果要残留底物的浓度很低，则生产能力往往较低。
多级全混式反应器理论模型的基本假设如下：
①每一级反应器都是全混式反应器，满足全混式反应器的基本假设；
②各级反应器中进出口流量相等并恒定；
即：Q1=Q2=…=Qi=…=Qn=Q
③各级反应器中的液体体积相等并恒定
即：Vi=V（i=1，2……n）
在上述条件下有：
各级反应器的生产能力为：（xi-xi-1）Di（i=1，2……n）
1.多级连续培养的物料衡算
现对第i级反应器作稳态物料衡算：
2.稀释率与理论级数的确定
（1）计算法
为了操作稳定起见，在实际选择稀释率D时，可考虑适当小于Dm。
根据此式可逐级确定各级反应器中的基质浓度，之后即可由下式计算各级的细胞浓度或产物浓度。
④当Si≤S时，停止逐级计算，从而确定了反应器的级数n和n级反应器中实际的残留底物浓度Sn。
（2）作图法 作图法系根据物料平衡方程式（6-101）和由分批培养取得的实验数据来设计连续培养的稀释率和级数，其主要步骤如下：
第一级反应器中的细胞浓度x1取生长速率最大时的细胞浓度（xm），在μx-x曲线上，连结点（x0，0）和（x1，μ1x1）。根据上式，可知直线的斜率即为稀释率D。
③自点（0，x1）引斜率为D的直线交μx-x曲线于点B，由此即可确定第二级反应器中的细胞浓度x2.依此类推可确定x3，x4……直至xn等于或大于预先确定的最终细胞浓度x为止。所引直线的次数即为反应器的级数。
若连续培养所要的是某些代谢产物而不是菌体，亦可用类似的方法确定稀释率D和各级反应器中产物的浓度Pi，进而可确定反应器的级数。
上述作图法是根据分批培养所得的μx-x曲线进行的，可能与连续培养中μx-x的关系有一定的出入。准确的作图法应采用连续培养条件下的μx-x数据。当用上述作图法所得结果，最后一级反应器的细胞浓度与所要求的细胞浓度有一定出入时，可适当调整稀释率D。
3.其他形式的多级连续培养
（1）浓缩细胞部分回流的多级连续培养 此多级连续培养系统可使反应器的生产能力提高，但需增加分离设备，且老细胞的积累较多，适合于底物浓度S0较低，且不要求细胞质量的场合。
（2）级间部分回流的多级连续培养 此多级连续培养系统，各级间有部分回流，这对连续培养过程的稳定性有一定的作用。此外，回流的稀释作用，会部分解除底物抑制作用，但级间回流会使老细胞积累。此种现象存在于多级塔式反应器连续培养系统，对于多级全混式反应器是不会采用级间部分回流的，因为这样要增加不少动力设备。
（3）底物浓度维持不变的多级连续培养 对于受底物浓度抑制的微生物培养，若采用一般的多级连续培养，则由于前面几级反应器中的底物浓度较高，而使细胞生长受到抑制。这时可采用从各级反应器中都连续流加底物的办法，来控制各级反应器中的底物浓度。在多级连续培养系统中，各级反应器中的底物浓度可分别控制。这样可保证各级反应器中的底物浓度Si均小于抑制细胞生长的底物浓度，从而可消除底物抑制，酵母菌的多级连续培养就是采用这种系统。
五、连续培养的应用
（一）连续培养在工业化生产中的应用
用连续培养进行发酵生产，与分批培养相比较，具有反应速度容易控制、设备生产率高和劳动强度低等优点。早在20世纪20年代就开始采用连续培养法生产饲料酵母，此后，人们对各种连续培养进行了大量的研究工作。虽然有关酵母、真菌、细菌、放线菌、原核生物、藻类等各种微生物连续培养的报道很多，但大多数都是试验性的，而不是大规模的工业化生产。到目前为止，有关工业化的连续培养生产有以下几个方面。
1.酵母、细菌等单细胞蛋白产品
20世纪20年代开始采用连续培养法生产饲料酵母，这是最早的单细胞蛋白产品。目前，由造纸厂亚硫酸盐废液连续培养生产饲料酵母较为普遍。到20世纪50年代末，以糖蜜为原料连续培养生产药用酵母和面包酵母的工业开始形成。由于酵母菌的生长受糖浓度的抑制，当糖浓度较高时，酵母进行有氧代谢产生大量酒精，从而使酵母得率下降。一般采用2～5个反应器串联，在各反应器中同时连续流加糖液，从第一个反应器开始，酵母浓度逐渐增高，但各反应器中糖的浓度却基本保持一致。与批式流加培养比较，其设备生产能力可提高50%左右。
2.酒精、啤酒、醋酸等一次代谢产物
酒精、啤酒、醋酸、葡萄糖酸等一次代谢产物的连续发酵开始于20世纪50年代初。50年代后期，国内外相继实现了糖蜜制酒精的连续发酵生产。20世纪60年代初，用淀粉质原料连续发酵制造酒精的工业化生产已获得成功。酒精连续发酵多采用10个左右的反应器串联，酒精浓度可达10%左右，发酵液的平均停留时间一般不到分批发酵时间的一半，只需30h左右。啤酒连续发酵的流程有多级搅拌罐式、多级塔式和单塔式三种，其中以单塔连续发酵较为多见。塔式啤酒连续发酵的特点是发酵速率高，塔内具有较高的酵母浓度，一般比分批发酵大16倍左右，因此，发酵时间大幅度降低。醋酸的连续发酵生产多采用单级自吸式反应器和塔式反应器。
3.污水的生化处理
用活性污泥处理废水普遍采用连续培养的方法。由于废水中的底物浓度相对较低，因而废水处理大多采用浓缩细胞部分回流的方法，以提高生物滤池的生产能力。
工业化连续培养应用较为广泛的国家有德国、加拿大、澳大利亚、新西兰和美国等。在我国连续培养的研究与生产始于20世纪50年代。目前已实现的有：由造纸厂亚硫酸盐废液连续生产饲料酵母，以糖蜜为原料连续生产药用酵母和酒精，用淀粉质原料生产酒精的连续发酵已被广泛应用。此外，污水的连续生化处理已被广泛采用，啤酒和面包酵母的连续发酵已完成了中间试验。
（二）连续培养在微生物生理特性和动力学研究中的应用
分批培养时，培养液中的菌体浓度、底物浓度等都是时刻在变化的，培养体系一直处于不稳定状态。而连续培养时，菌体的生长速率受限制底物浓度的控制，培养液中的菌体浓度和底物浓度等可以保持恒定，即环境条件可以保持不变，培养体系处于稳定状态。因此，通过连续培养的稳定状态可以了解微生物的生理性质。对于单级连续培养，在稳定状态下，稀释率等于比生长速率，根据此原理，可测定微生物的比生长速率，进而可测定微生物的动力学参数。目前，广泛应用连续的小型实验设备来进行这方面的研究。
1.微生物生理活性的研究
在稳定状态下，微生物细胞内各种活性物质（酶、RNA、DNA等）都是恒定的。当微生物的比生长速率发生改变时，即改变培养液中限制底物的浓度时，微生物细胞内的各种活性物质含量可能有所变化。通过对各种限制底物浓度的研究，即可选定最佳的环境条件，为大型生产的培养条件提供依据。
2.微生物动力学参数的测定
（1）μmax与KS的测定 见“单级连续培养”部分。
在连续培养条件下，测定某一稳态时的细胞表观得率；改变稀释率D，在到达另一稳态时，再测定其值Yx/S。根据一系列的（Yx/S，D）值即可用作图法求得细胞的理论得率YG与维持系数m。
3.稳定状态的过渡
在连续稳态过程中，当增加或减小稀释率D时，反应过程将从一个稳态过渡到另一个稳态。
忽略细胞死亡，对反应器作过渡阶段的细胞质量衡算：
上述计算还没有考虑到改变环境后，微生物需要一定的适应时间，一般而言，微生物连续培养从一个稳态到达另一个稳态，培养需要10个左右的体积替换才行。如果想缩短过渡态的时间，可进行人为的干扰。若从一个稳态到另一个稳态时，稀释率是减少的，即可采用一般分批培养使细胞浓度迅速提高；若从一个稳态到另一个稳态时，稀释率是增大的，即可采用更大的稀释率使细胞浓度迅速下降。
（三）连续培养在菌种分离与改良中的应用
菌种是发酵工业的基础，开发发酵新产品和提高现有发酵产品的生产水平都离不开菌种的选育。自然界中的微生物是普遍存在的，然而每一菌种的特性、嗜好、形态都是有区别的，它们都只能在一定的环境条件下生长和生存。菌种的选育就是通过改变各种环境条件，或淘汰大多数不需要的菌种，从中挑选出所需的菌种（即筛选）；或使现有菌种产生变异，从中选育出高产的新种（即育种）。连续培养的应用，有可能建立高度选择性的环境条件，以选育出所希望的菌种。与一般的菌种分离方法比较，应用连续培养选育新种具有如下特点：
①在筛选菌种时，一次连续培养可在期间多次改变培养条件，以使不需要的混杂的微生物菌种逐渐淘汰。而一般的筛选方法需经4次以上分离与筛选。
②在采用极端培养条件（如极端温度、极端pH）筛选菌种时，可适当减弱极端条件，这样有利于避免所需菌种的淘汰。因为在连续培养条件下，并不一定要使不需要的微生物菌种死亡，只要其培养条件不适宜这些不需要的微生物的生长即可。在连续培养过程中，对于不生长或者生长缓慢的微生物菌种将会自然洗出而淘汰。
③在一定培养条件下，通过一次连续培养可从众多菌种中选出高产菌株。将所收集的众多菌株同时接种进行连续培养，在培养过程中逐渐提高稀释率，生长速率慢的菌种将逐渐被洗出而淘汰，最后剩下的即为高生长速率的菌株。这种方法曾用在利用废液生产饲料酵母的菌株选育上，已获得成功。
④连续培养为生长中自发产生的变异株的选择提供了无限量的时间条件。由于连续培养具有优者生存、劣者淘汰的特点，因此经长时间的连续培养后，有可能选育出优于原菌种的变异株（即生产育种）。
六、关于连续培养的一些问题
自20世纪20年代首先采用连续培养法生产饲料酵母至今，人们对于连续培养的研究从未间断。然而大多数连续培养都是实验室性质的，大规模的连续培养生产在整个发酵工业中是很少见的。连续培养有某些固有的实际问题有待解决，这些问题的存在妨碍了连续培养的应用。
（一）无菌状态的保持（污染问题）
长时间保持无菌状态是连续培养的问题之一。营养成分和空气的不断流入增加了杂菌污染的机会，而且连续培养的周期越长，杂菌侵入的机会也就越多。为了保持连续培养的无菌状态，对培养基和空气的灭菌要求往往比分批培养要严格得多。不过，即使是采用了设计最恰当的纤维空气过滤器，杂菌仍然有机会通过过滤器最后进入培养基。培养基灭菌也是一样，纵使一切操作都非常注意，也不可能使杂菌进入培养基的几率绝对等于零。
在连续培养过程中，除了严格控制培养基和空气的灭菌外，防止杂菌污染最好的办法是选择独特的培养环境，使杂菌不宜生长或者生长非常缓慢。连续培养特定环境条件选择的可能途径有：
①使用过高温度或极端pH培养，可使培养过程不受常温菌或中性菌的污染。
②采用独特的底物或培养基，使一般杂菌不能利用或者生长非常缓慢。
③选育抗性菌株，在培养基中添加某种化学物质或抗生素，从而抑制其他杂菌的生长。
④选育具有嗜杀性能的菌株，使之在培养过程中抑制杂菌的生长。
⑤选育高比生长速率的菌株，在培养过程中采用较高的稀释率，从而可使比生长速率较低的杂菌在培养过程中自然洗出。
为了更好地了解连续培养过程中杂菌的污染问题，必须掌握连续培养过程中杂菌污染的特征。根据在连续培养条件下，杂菌的比生长速率是否大于或等于培养菌的比生长速率，可将杂菌分为三类。现以X表示培养菌，其比生长速率为μ；Y、Z、W表示三类不同的杂菌，其比生长速率分别为μY、μZ、μW。
对于Y类杂菌，μYμ
可见，随着连续培养的进行，杂菌Y将被自然洗出。因此，对于比生长速率小于培养菌的杂菌，只要培养基或空气中不是连续侵入大量杂菌，就不会对连续培养过程造成污染。
如果培养基中不断侵入Z类杂菌，将会使反应器中的杂菌越积越多，直至浓度超过培养菌以后，达到某一平衡为止，从而造成污染。如果z0=0，则dz/dt=0，在此情况下，反应器中的杂菌浓度将维持不变。通过上述分析可知，对于Z类杂菌，一旦侵入就会在反应器中维持一定的浓度，重复侵入后将会使反应器中的杂菌浓度逐渐增加。因此，这类杂菌往往是在连续培养过程进行了相当长的时间后才形成污染。
由于μW>；D=μ，因而dw/dt必大于零。由此可知，此类杂菌一旦侵入，则不论是否再侵入新的杂菌，都会使反应器中的杂菌越积越多，直至将培养菌洗出。因此，在连续培养中，必须严格控制这类杂菌的侵入。
（二）菌种变异与退化
菌种的变异与退化是连续培养的又一个问题。在许多场合，菌种的变异与退化决定了连续培养的周期的长短。就微生物变异的一般规律而言，经常处于旺盛生长繁殖状态的细胞，发生变异的几率比处于休眠状态的细胞要大得多。连续培养时，微生物一直处于对数生长阶段，因而其变异的可能性更大。大多数变异并不影响生产，但当变异菌株较之原生产菌株更适应于培养环境，而具有更快的生长速率时，其就会在发酵液中越积越多，最终占据优势而左右发酵进程。
在以往连续培养的研究和生产中，发现菌种变异和退化的例子很多。如由链霉菌（Streptomyces niveus）产生新生霉素的产量在连续培养28d内下降；由黄色青霉菌生产青霉素的产量在连续培养25d内下降；由委内瑞拉链霉菌生产氯霉素，在合成培养基中连续培养，其产量在6～40d下降至零。又如鼠疫杆菌在连续培养中抗原性能发生退化，但其最高抗原效价可通过不同温度的两级培养的方法予以保持（第一级培养28，第二级培养37）。此外，还有一种变化现象也影响连续培养的继续进行。例如在相当高的稀释率下连续培养面包酵母，经几天后，酵母形态发生明显变化，个体变小、变长，并出现假丝现象，这种假丝状酵母由于表面粗糙和不耐贮存，因而不能用来生产优质的面包酵母。但是这种假丝状酵母并不是酵母细胞发生了变异，因为将其转移至通风较差的摇瓶中缓慢生长一段时间后又转变成正常的椭圆形酵母。
（三）均匀性与稳定性
所谓全混式反应器是一种理想模型。实际上，任何形式的反应器都不可能保证反应器中各物质的浓度总是均匀一致。在高稀释率下培养时，均匀性问题往往不会对培养过程产生明显影响。因为当比生长速率较高时，其培养液中的底物浓度也相对较高，反应器中底物浓度的一定差异不会对微生物生长产生多大影响。但在低稀释率培养时，其培养液中的营养物浓度往往较低，若反应器的均匀性较差，则可能会在某些区域出现营养物严重不足的现象，而影响微生物的正常生长。由此可知，对于低稀释率的连续培养，特别是在黏稠培养基和大型设备情况下，如何保证整个培养器中营养物均匀一致的问题显得非常重要。增加通风量或提高机械搅拌的强度能有效地改善反应器的均匀性，但对低稀释率的连续培养来说，无疑是增加无用的功率消耗。因为在低生长速率的连续培养中，只需较小的通风和较弱的搅拌即可满足供氧的要求。因此，对于稀释率低的连续培养，要注意选择混合效果较好的反应器。反应器的规模也不宜太大，因为反应器的混合效果随着规模的增大而降低。
另一方面，在高稀释率下，稳定性成为连续培养的又一问题。为了使连续培养在较高的生产能力下进行，就必须选择较大的稀释率。从前面所学的理论可知，最大生产能力下的最适稀释率Dm与洗出时的临界稀释率Dc非常接近。在连续培养中由于加料设备的不稳定性和培养基中营养物浓度的变化等因素，有可能使培养过程发生洗出现象。在实验室的小型试验中加料设备的稳定性极为重要，但在大型的反应器中问题并不严重。
